アクチン・ミオシン複合体の結晶化の試みとX線回析

尝试结晶肌动蛋白-肌球蛋白复合物和 X 射线衍射

• 批准号: 06235209
• 负责人: 若林 克三
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06235209/
• 关键词: アクチンモノマー; 非重合アクチン; ミオシンヘッド; アクトミオシン; X線小角散乱; 結晶化

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱による溶液構造解析を併用してエネルギー変換中のアクトミオシン分子の構造解明を目指した。(1)改良されたDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部複合体の調製。すでに二価性架橋剤マレイミドベンゼン酸エステル(MBS)で難重合性アクチンとミオシン頭部との架橋複合体を形成させることに成功し、ATPによりアクチン結合部位が頭部上で1-2nm変位することを示唆する電顕観察を昨年度報告した。しかし高蛋白濃度で2:1複合体を形成し重合する欠点があった。アクチンのサブドメインIIのチロシン53をジアゾニウムテトラゾル(DHT)で化学修飾した。その結果、ファロイジンを作用させても全く重合しないアクチンモノマーが調製できた。MBS-アクチンを化学修飾してできたDHT/MBS-アクチンはDHT-アクチンより安定で、ミオシン頭部と1:1に結合した。さらにMBSによりアクチンとミオシン頭部S1との1:1架橋複合体を形成させることに成功した。この架橋複合体モノマーをカラムクロマトグラフィーにより分離精製することにも成功し、X線溶液散乱実験と結晶作成の試料とした。(2)アクチン・ミオシン頭部複合体のX線溶液散乱実験。MBS-アクチンのX線溶液散乱実験はすでに行い、分子の形態を表す慣性半径、分子コード長、分子間相互作用を示す慣性半径の濃度依存性などは未処理のG-アクチンとほぼ同じであった。しかし結晶解析されたアクチン分子とは慣性半径、コード長は少し大きかった。現在この違いが何によるのか水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル計算により検討している。MBS-アクチンまたはDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部S1と1:1に混合した試料、DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーの試料についてX線溶液散乱実験を開始した。予備的実験によると慣性半径はS1単独に比べかなり大きいことがわかった。(3)アクチン・ミオシン頭部複合体の結晶化。DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーを試料として結晶化を試みている。蒸気拡散法を主に使用しマイクロプレート上でスクリーニングした。以上、現在までアクチン・ミニオン複合体モノマーの結晶化には至っていないが、これらの試料のX線溶液散乱実験はかなり進展した。現在結晶化を精力的に押し進めている。

The molecular structure of protein is understood by the method of crystallization, X-ray crystal structure analysis, solution X-ray scattering and solution structure analysis. (1)Improved modulation of DHT/MBS head complexes. The results show that the formation of a binary bridging complex (MBS) is successful, and the ATP binding site is 1- 2 nm above the head. High protein concentration and 2:1 complex formation The first step is to reduce the number of users to 53. The second step is to reduce the number of users to 53. The result is that the number of users can be adjusted to match the number of users. MBS-6 is chemically modified to DHT/MBS-6 is chemically stable, and MBS-6 is chemically modified to DHT/MBS-6 is chemically bound to DHT/MBS-6. A 1:1 bridging complex was successfully formed in the head of MBS. The bridge complex was separated and purified successfully, and the X-ray solution was dispersed and crystallized. (2)The X-ray solution of the head complex is scattered. X-ray solution dispersion of MBS-C particles, molecular morphology, inertial radius, molecular length, molecular interaction, concentration dependence of inertial radius, untreated G-C particles, and molecular morphology. Crystal analysis of the molecules of inertia radius, long and small The coordination of water molecules and the internal motion between them are discussed in this paper. MBS-DHT/MBS- The radius of inertia is S1. (3)Crystallization of the Jakocin·Mioschin head complex. DHT/MBS-1 bridge complex The main method of evaporation is to use the evaporation method. The crystallization of the above complex is progressing to the X-ray solution dispersion of the sample. Now the crystallization of energy is committed to the future.

项目成果

M. Tokunaga: "Structural Change of the Myosin Head Detected by Electron Microscopy and Small-Angle X-ray Scattering" Synchrotron Radiation in the Biosciences eds. (B. Chance et al.), Oxford Univ. Press, Oxford. 1. 493-501 (1994)

M. Tokunaga：“通过电子显微镜和小角 X 射线散射检测到的肌球蛋白头的结构变化”生物科学编辑中的同步辐射。

Y.Sugimoto: "Conformational Change of the Myosin Heads during Hydrolysis of ATP by X-ray Solution Scattering" Biophys.J.68(in press). (1995)

Y.Sugimoto：“X 射线溶液散射水解 ATP 过程中肌球蛋白头的构象变化”Biophys.J.68（出版中）。

T.Arata: "Two G-Actin-Binding Sites of Myosin Head in the Absence and Presence of ATP" Biopys.J.68(in press). (1995)

T.Arata：“ATP 不存在和存在时肌球蛋白头的两个 G 肌动蛋白结合位点”Biopys.J.68（印刷中）。