超生物界の進化解明のための高温環境土壌16SrDNAライブラリー解析

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本研究は微生物を培養することなく、温泉の噴き出し部位に位置する高温環境条件下で圧倒的多数を占めていると考えられる培養困難な細菌群の16SリボソームRNA遺伝子群をPCR増幅およびクローン化し、それらの配列データを分子進化学的に解析することにより真正細菌の進化および多様性を解明する上で有用な基礎的知見を得ることを目的としている。別府温泉かまど地獄の温泉噴き出し部位(95度)のごく周辺(72度)から深緑色のMicrobial Matおよび土壌を採取し液体窒素で凍結保存した。Freeze-Thaw Cycle処理することによりDNAを抽出し、PCR(30サイクル)を行うことにより約300bpの16SrDNA断片を増幅させた。なお、土壌サンプルからは遺伝子増幅できなかったためMicrobial Matの解析を進めた。得られた増幅DNA断片をpT7BlueT vectorにつなぎ大腸菌に形質転換することによって16S rDNAライブラリーを作成した。ライブラリーから無作為に10クローンを選択し、両鎖から遺伝子構造を決定した。ODENおよびMEGAを用いて得られた遺伝情報を分子進化学的に解析した。その結果、極限環境であるにも関わらず、単離した遺伝子群はいずれも真正細菌に属しており、古細菌型は検出できなかった。今回、解析したclone群(HOT1-10)はAquifex,Cyanobacteria,Proteobacteria,Cytophagaのクラスターに位置するものだけでなく、現在知られているいずれの真正細菌Kingdomとも系統関係が大きく離れているグループ(HOT1,2,3)が存在することが確認できた。また、真正細菌の多くのkingdomにわたってclone(HOT)が検出できた事実は、真正細菌の共通祖先が高温菌だった可能性を示唆している。