ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

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生体内の糖代謝において中心的な役割をもつUDP-グルコースの合成と分解に与るUDP-グルコース合成酵素酵素について、重原子同型置換法によるX線結晶構造解析を行い、ソルベントフラットニングによる電子密度の改良の後、モデルビルディングを終了した。その結果、本酵素サブユニットは、大小2個のドメインで形成されており、その一方は、左巻きβらせん構造という新規なホールディングモチーフをもつことが明らかになった。また、これまでにジャガイモ酵素について、種々の親和標識試薬を用いる研究を行って、活性部位に存在する複数のリジン残基の同定とそれらの空間的配置の推定を行ってきたが、これらのリジン残基は、いずれも活性部位と考えられる領域に存在することが判明した。現在、この結晶構造の精密化と、糖ヌクレオチド結合部位を構成するアミノ酸残基を置換した各種変異型酵素の結晶化を行っている。また、糖ヌクレオチド基質を結合した酵素の構造を解析するとともに、基質結合過程の構造変化をラウエ法による時分割測定により解析中である。一方、アデニル酸キナーゼはAMPをリン酸化してADPを合成する酵素で、これまでにニワトリ筋肉酵素のヌクレオチド結合部位にあるリジン残基やその周辺に存在する数種のアミノ酸残基の役割を明らかにしてきた。平成7年度では、本酵素と同じ反応様式をもつが、基質特異正の異なるUMP-CMPキナーゼを対象として、タンパク質工学的手法による基質特異性の改変を試みるとともに、ヌクレオチド結合領域の動的構造をアデニル酸キナーゼと比較しながら解析した。