嫌気呼吸系金属酵素の構造と機能

无氧呼吸系统金属酶的结构与功能

• 批准号: 08249203
• 负责人: 祥雲 弘文
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08249203/
• 关键词: 脱窒; カビ; P450nor; Fusarium oxysporum; 硝酸塩還元酵素; 亜硝酸塩還元酵素

本研究は、当研究室で発見されたカビ脱窒系の構成成分である金属タンパク質について、構造、機能、電子伝達系との相互作用などを明かにし、ミトコンドリア嫌気呼吸系におけるエネルギー産生機構を解明することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。1.Fusarium oxysporumの硝酸塩還元酵素は細菌の酵素同様、膜タンパクであり、完全精製が困難であったが、本酵素を可溶化し、ほぼ均一にまで精製することができた。今後は部分アミノ産配列を決定し、PCR法などを用いて遺伝子の取得を目指す。2.亜硝酸塩還元酵素およびアズリンの部分アミノ産配列をさらに多く決定し、遺伝子の取得を試みているが、未だ成功していない。3.P450norのX線結晶解析に成功し、このユニークなP450の立体構造が明かとなった。全体的な高次構造は他のモノオキシゲナーゼP450によく似ていたが、ヘム遠位側に大きなオープンスペースが形成されていた。このスペースはNADH結合部位であると予想した。また、CylindrocarpontonkinenseのP450nor2とのキメラタンパクの特異性から、アミノ末端側にNADH結合部位の存在することを予想した。そしてB'ヘリックス中にNADH結合モチーフによく似た配列を見いだし、その中のGをVに変えた変異体の酵素活性が大きく減少することを確認した。このNADH/NADPH特異性決定部位について今後さらに検討する。

The purpose of this study is to clarify the interaction between metal, substance, structure, function and electron transport systems in the respiratory system. The following results were achieved during the year. 1. Fusarium oxysporum nitrate reducing enzyme is difficult to dissolve and purify completely. In the future, the PCR method will be used to determine the allocation of genes. 2. Nitrate reduction enzyme and partial breakdown of production and distribution are determined in many ways, and the acquisition of the enzyme is not successful. 3. X-ray crystal analysis of P450nor was successful, and the three-dimensional structure of P450 was clear. All the high-order structures are formed in the same way as those on the other side of the P450. The NADH binding site was identified. The existence of NADH binding sites on the terminal side of the P450nor2 segment of the Cytocarponkinense is expected. The activity of NADH in the medium was significantly reduced. This NADH/NADPH specificity determining site is currently under investigation.

项目成果

N.Nakayama: "Cytochrome P450foxy,a catalytically self-sufficient fatty acid hydroxylale of the fungus Fusarium oxysporum." Journal of Biochemistry. 119・3. 435-440 (1996)

N. Nakayama：“细胞色素 P450foxy，真菌尖孢镰刀菌的催化自给自足脂肪酸羟化物。”《生物化学杂志》119·3（1996）。

N.Okamoto: "Fungal P450nor : Expression in Escherichia coli and site-directed mutageneses at the putative distal region." Archives of Biochemistry and Biophysics. 337・2. 338-344 (1997)

N.Okamoto：“真菌 P450nor：在大肠杆菌中的表达和假定远端区域的定点诱变。”生物化学和生物物理学档案 337・2（1997 年）。