シトクロムP450水酸化酵素系電子伝達機構の物理化学及び遺伝子工学的研究

细胞色素P450羟化酶系统电子传递机制的物理化学与基因工程研究

• 批准号: 08249237
• 负责人: 三浦 成敏
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08249237/
• 关键词: P450; Adrenodoxin; 電子伝達; 構造変化; アドレノドキシン還元酵素

アドレノドキシン(Ad)は活性中心に[2Fe-2S]クラスターを持つ水溶性の電子伝達タンパク質であり、ミトコンドリア型P450電子伝達系においてNADPH-アドレノドキシン還元酵素(AdR)とシトクロムP450SCC及びP45011βの間の電子伝達体として機能している。アドレノドキシンHis56の部位指定変異タンパク質であるH56R、H56Aはアドレノドキシン還元酵素との電子伝達活性の指標となるシトクロムcの還元反応においてWTに比べKm値が増加し、P450SCCとのKs値も上昇した。またHis56変異体の1H-NMR芳香族領域のシグナルではWTに比べH56RでTyr82、H56AでPhe59のケミカルシフトに変化が観察された。Ser88の変異体であるS88A、S88TもHis56変異体と同様に電子伝達活性が低下した。さらに1H-NMRの芳香族領域のシグナルはWTとS88AでHis56のC2-Hのみで違いが見られ、S88Aでは低磁場側に0.17ppmシフトしていた。このHis-56のC2-HのNMRシグナルはWTではpH5.8〜8.5の間でpH変化を示さず、ヒスチジン残基としては異常に低いpK値を持っているが、S88Aではシフトが観察されpHに依存するようになった。WTにおいてHis56のC2-HとSer88のCβ-Hは数オングストローム内に近接しており、さらにWTではpH依存性を示さないHis56のC2-HがS88AではpHに依存するようになったことから、Ser88の水酸基とHis56のイミダゾール基での水素結合の可能性が強く示された。S88A、S88Tでは水素結合がなくなり、電子伝達能が低下したと考えられる。Phe43の変異タンパク質の発現量はSDS電気泳動の結果からは、すべての変異体でWTと同程度であったが、菌体粉砕後の吸収スペクトルはF43A、F43SでWTに似た吸収スペクトルが得られづ、電子伝達活性も認められなかった。このことは鉄イオウクラスターがF43A、F43Sでは配位していないことを示している。F43Y、F43W、F43I、F43Lの電子伝達活性は、WTとほぼ同様であった。側鎖の小さいAlaやSerに置換すると活性型のアドレノドキシンの発現が著しく減少することから、Phe43の機能は鉄イオウクラスターの安定化であることが示された。

アドレノドキシン(Ad)はActive Centerに[2Fe-2S]クラスターをholdつWater-soluble electronic denda タンパクquality であり, ミトコンドリア type P450 electronic denda System of NADPH-アドレノドキシン reducing enzyme (AdR)とシトクロムP450SCC and P45011β are electronic and functional.アドレノドキシンHis56のpart designated 変different タンパクquality であるH56R, H56A はアドレノドキシン reducing enzyme とのelectronics The indicator of activeness is となるシトクロムcの元濜においてWTに比べKm〤がincrease and increaseし, P450SCCとのKsつもriseした.またHis56 variant 1H-NMR aromatic field のシグナルではWT に比べH5 6R, Tyr82, H56A, Phe59, etc. Ser88's allotypes are S88A and S88T, His56's allotypes are the same and their electronic activity is low.さらに1H-NMRのaromatic fieldのシグナルはWTとS88AでHis56のC2 -H のみでviolation いが见られ, S88A では low magnetic field side 0.17ppm シフトしていた.このHis-56のC2-HのNMRシグナルはWTではpH5.8~8.5の间でpH変化をshowさず、ヒスチジとしては abnormal low いpK っていをhold っているが, S88A ではシフトが観看されpH にdependence するようになった. WTにおいてHis56のC2-HとSer88のCβ-Hはnumberオングストしており、さらにWTではpHdependencyをshowさないHis56のC2-HがS88AではpHにdependenceするようになったことから、Ser88のThe water acid base and His56's のイミダゾール base and the possibility of water binding are strong and strong. S88A, S88T is a hydrogen-conjugated product, and an electronic dannon is used to reduce the water content. Phe43 is a different type of material and is of the same quality as SDS electrophoresis and the results of Phe43 electrophoresis, and is a different type of WT and has the same degree of bacterial cell powder. After the absorption of F43A, F43S, WT, absorption, and electronic absorption, the electronic activeness of F43S is achieved.このことは鉄イオウクラスターがF43A, F43Sではcoordinated していないことを时している. F43Y, F43W, F43I, F43L are electronic and active, and are the same as WT. Side lock さいAlaやSerにreplacement するとactive type のアドレノドキシンの発appears が出しくreduceすることから、Phe43's function is stable and stable.