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HIV-Tatに相互作用する細胞因子のクローン化と機能解析

与 HIV-Tat 相互作用的细胞因子的克隆和功能分析

基本信息

批准号：
08269201
负责人：
加藤宏幸
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08269201/
关键词：
HIV Tat 転写 TFIIH キナーゼ蛋白間相互作用

项目摘要

酵母two-hybrid系によってTatに相互作用する細胞因子をスクリーニングし、その候補(TAM2)を得た。さらにヒト胎児脳cDNAファージライブラリーをスクリーニングし、全長cDNAを得た。この結果、TAM2は322(または305)アミノ酸の蛋白をコードする分子量33.0kDa、等電点9.40の蛋白であった。特徴的な点は、HRXのシステイン領域に類似性を持ち、N末端にセリン、グリシンに富んだリン酸化を受け易い領域が存在することである。northern blot解析により、2.6kbと2.2kbのTAM2mRNAがほとんどすべての組織に発現していた。これはTatが細胞株に依存せず活性化できることに合致する。次にTat変異体とTAM2との相互作用を調べた。コア領域は相互作用に必須であること、N末端領域(1-21アミノ酸)およびシステイン領域(22-31アミノ酸)は相互作用を安定化する、塩基性領域は構造的に必要であると結論した。また、TATとの相互作用にはTAM2のC末端の219-322アミノ酸のみが必要であった。この領域に存在するシステインに富んだ配列が相互作用に重要であることが示唆された。以上の酵母細胞内の相互作用をin vitroにおいて確認した結果、TatはTAM2に効率的(30-50%)に結合し、過剰量のHeLa核蛋白によっても阻害されなかった。Tatと細胞由来のプロテインキナーゼの相互作用が報告されていることから、TAM2とCTDキナーゼであるTFIIHとの相互作用を検討した。その結果、TAM2はTatと同様にHeLa細胞核抽出液中のTFIIHの構成因子であるcyclinHおよびcdk7を共沈させることが判明した。これによりTAR RNA上においてTatはTAM2を介してTFIIHに結合し、TFIIHがRNAポリメラーゼIIの転写開始または伸長の過程を活性化することが示唆された。

The yeast two-hybrid system is a candidate for Tat interaction. The full length cDNA was obtained from the cDNA library. As a result, TAM2 has a molecular weight of 33.0 kDa and an isoelectric point of 9.40. Characteristics of the point, HRX system domain similarity, N-terminal system, rich system acidification, the existence of the domain Northern blot analysis revealed that TAM2 mRNA, 2.6 kb and 2.2 kb, was present in the tissue of the mouse. Tat cell line dependent activation Tat and TAM2 interact with each other. N-terminal domain (1-21 amino acid) and N-terminal domain (22-31 amino acid) are necessary for interaction stabilization and structure of N-terminal domain. The interaction between TAT and TAT is necessary for the C-terminal of TAM2 at 219-322. This domain exists in the form of a rich set of interactions. The above interactions in yeast cells were confirmed in vitro, and Tat Tam2 binding efficiency (30-50%) and HeLa nuclear protein inhibition were observed. The interaction between Tat and Tam is discussed. TFIIH components in nuclear extracts from HeLa cells were identified. Tat Tam2 is the first to activate the RNA sequence.