Na^+輸送性液胞ATPaseの分子構築とイオン共役機構の解析

Na^+转运液泡ATP酶的分子构建及离子共轭机制分析

• 批准号: 09257206
• 负责人: 柿沼 喜巳
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257206/
• 关键词: ナトリウム; ATPase; 液胞ATPase

(i)Na^+-ATPaseオペロン全領域を有するマルチコピープラスミドpKAZ191(約15kb)を作製し、Enterococcushiraeに導入することに成功した。細胞膜における本酵素の大量発現が可能になり、本酵素をほぼ100%の収率で膜から可溶化し、さらに10-30%グリセロール密度勾配遠心を行うことによりその完全精製に成功した。SDS-PAGEにより精製標品は9個のポリペプチドから構成されていることがわかった。それらがNa^+-ATPaseオペロンの中にある9つのシストロンの遺伝子産物(NtpA、-B,-C,-D,-E,-F,-G,-I,-K)から構成されていることを、各ポリペプチドのN末端部分アミノ酸配列の決定及びペプチド抗体に対する反応性等から証明した。(ii)精製酵素標品をEDTA処理することにより、ATPase触媒頭部部分V_1はV_0部分から解離した。この方法によってNtpA,-B,-C,-D,-E,-FサブユニットはV_1部分を、NtpI,-K,-GサブユニットはV_0部分を構成するポリペプチドと帰属された(iii)精製標品は硝酸、N-ethylmaleimide、NBD-Clなどの液胞ATPaseに対する典型的な阻害剤によって阻害された。さらに液胞ATPase触媒頭部V_1に作用するといわれているペプチド抗生物質destruxin Bによっても阻害を受けた。しかしながら膜貫通部分V_0に作用すると考えられるbafilomycinA_1,concanamycinAによる作用は極めて弱いことがわかった。(iv)精製標品は、プロテオリポソームの再構成系でATP駆動性のelectrogenicな^<22>Na^+の能動輸送活性を示し、ここに本酵素の完全精製、再構成系が確立された。

(i)Na^+-ATPase was successfully introduced into pKAZ191(about 15kb) in the whole field. A large amount of the enzyme can be produced in the cell membrane. The enzyme can be dissolved in 100% of the cell membrane. The enzyme can be completely purified in 10-30% of the cell membrane. SDS-PAGE analysis of the refined standard is composed of 9 groups. In the Na^+-ATPase sequence, 9 of the sequence products (NtpA, -B,-C,-D,-E,-F,-G,-I,-K) were found to be composed of the N-terminal part of each molecule, the determination of the acid sequence, and the antigenicity of the antibody. (ii)The purified enzyme standard was treated with EDTA, and the ATPase head part V_1 and V_0 were dissociated. The method consists of NtpA,-B,-C,-D,-E,-F, NtpI,-K,-G, and V_0.(iii) The purification standard is composed of nitric acid, N-ethylmaleimide, NBD-Cl, and typical inhibitors for cellular ATPase. In addition, the effect of destruxin B, an antibiotic, on the activity of V_1 in the cell catalyst head was also studied. The membrane penetration part V_0 acts as a weak link between the membrane penetration part V_0 and the membrane penetration part V_1. (iv)The purification standard was characterized by ATP mobility, <22>Na^+ transport activity and complete purification of the enzyme.

项目成果

T.Murata, K.Tokose, I.Yamato K.Igarashi, and Y.Kakinuma: "Purification and reconstitution of Na^+ trarslocating vacaolar ATPase from Enterecoccus hiral" Journal of Biological Chemistry. 272(40). 24885-24890 (1997)

T.Murata、K.Tokose、I.Yamato K.Igarashi 和 Y.Kakinuma：“来自肠球菌的 Na+ 转运液泡 ATP 酶的纯化和重建”生物化学杂志。