複製フォーク複合体の形成とその制御機構の研究

复制叉复合物的形成及其调控机制研究

• 批准号: 12141203
• 负责人: 釣本 敏樹
• 金额: $ 32.26万
• 依托单位: Kyushu University (2003-2004)Nara Institute of Science and Technology (2000-2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12141203/
• 关键词: WRNヘリカーゼ結合因子; DNAポリメラーゼδ; 染色体接着; クランプローダー; クランプ; ATPase; ユビキチン; DNAポリメラーゼ; チェックポイント; PCNA結合蛋白質; 質量分析; 電子顕微鏡; DNAのメチル化; 再構築; PCNA; DNAメチル化酵素; CDK; サイクリン; p21

1.WRNヘリカーゼ結合因子(WRNIP1)による複製フォーク進行制御ヒトWRNIP1はWRNヘリカーゼに結合するだけでなく、ヒトDNAポリメラーゼδと特異的に相互作用する。この因子の複製活性制御に係わる機能を明らかにするため、ヒトWRNIP1の発現系を構築し精製した。その結果、8量体複合体として振る舞い、DNAにより促進されるATPase活性を有した。またDNAポリメラーゼδの合成開始効率を上昇させることを明らかにした。さらに、この活性促進がATPase活性によって負に調節を受けることから、複製フォーク進行時に、DNA損傷を感知しながらDNA合成活性の制御を行っていることが示唆された。2.複製フォーク進行と染色体接着の連係機構の解析染色体接着に関与するChl12-RFC複合体が複製クランプPCNAの第2のローダーとして機能することを明らかにした。このことはPCNAクランプを介して複製フォークの進行と染色体接着反応が連係していることを意味する。さらに細胞の粗抽出液を使った反応系ではChl12-RFCによるPCNAローディングが見られないことから、細胞内ではPCNAローダーを使い分ける機構があることが考えられた。そこで、細胞抽出液を分画し、その特異性因子を検索し、Chl12-RFCによるPCNAローディングを抑制する因子と共に、Chl12-RFCによって特異的に促進を受けるDNAポリメラーゼ活性を見出した。3.ユビキチン化PCNAの精製と機能解析PCNAのユビキチン化がどのように複製フォーク進行制御に係わっているかを明らかにするため、最低1個のサブユニットが必ずユビキチン化されたPCNAを作成し、その機能変化を解析した。その結果、DNAローディング活性は影響を受けなかったが、PCNAの標的となるDNAポリメラーゼの中に活性が抑えられるものがあることが示された。

1。通过WRN解旋酶结合因子（WRNIP1）调节复制叉进程不仅与WRN解旋酶结合，而且与人DNA聚合酶δ特别相互作用。为了阐明控制该因素的复制活动所涉及的功能，构建并纯化了人类WRNIP1表达系统。结果，它作为八聚体复合物的表现，并具有由DNA促进的ATPase活性。还表明，DNA聚合酶δ的合成启动效率增加。此外，由于该活性促进受ATPase活性负调节，因此建议在复制叉进展过程中感测DNA损伤的同时控制DNA合成活性。 2。分析复制叉进程和染色体粘附的连锁机制，已经表明，与染色体粘附有关的CHL12-RFC复合物是复制夹具PCNA的第二个装载机。这意味着复制叉的进展和染色体粘附反应通过PCNA夹连接。此外，在使用粗细胞提取物中，在反应系统中未观察到CHL12-RFC的PCNA负载，因此人们认为存在一种机制，可以在细胞内使用不同的PCNA装载机。因此，将细胞提取物分离，并搜索其特异性，并发现了DNA聚合酶活性，以及​​抑制CHL12-RFC负载PCNA的因子，该因素是由CHL12-RFC特别促进的。 3。对泛素化PCNA的纯化和功能分析，以阐明PCNA的泛素化如何参与复制叉进程的调节，PCNA始终以至少一个亚基泛素化，并分析了功能变化。结果表明，尽管不影响DNA负荷活性，但抑制了由PCNA靶向的一些DNA聚合酶。

项目成果

Tadokoro, R. et al.: "Scheduled Conversion of Replication Complex Architecture at Replication Origins of S. cerevisiae during the cell cycle"J Biol Chem.. (In press). (2002)

Tadokoro, R. 等人：“细胞周期期间酿酒酵母复制起点处的复制复合体结构的预定转换”J Biol Chem..（正在出版）。

Tsurimoto,T.: "Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions-Applications of BIACORE (ed.K.Nagata and H.Handa)"DNA polymerase δcomplex.. 10 (2001)

Tsurimoto, T.：“生物分子相互作用的实时分析 - BIACORE 的应用（ed.K.Nagata 和 H.Handa）”DNA 聚合酶 δcomplex.. 10 (2001)

釣本敏樹: "生化学誌特集「DNAポリメラーゼ」:DNAポリメラーゼδ"日本生化学会(In press). (2002)

Toshiki Tsurimoto：“生物化学杂志特稿‘DNA 聚合酶’：DNA 聚合酶 δ”日本生化学会（正在出版）（2002 年）。

釣本敏樹: "松影昭夫・正井久雄編、「ゲノムの複製とその制御」シュプリンガー・フェアーラーク東京"クランプとクランプローダー. 10 (2002)

Toshiki Tsurimoto：“Akio Matsukage 和 Hisao Masai（编辑），‘基因组复制及其控制’，Springer Verlag Tokyo”Clamps and Clamp Loaders 10 (2002)。

Shikata,K.: "The Human Homologue of Fission Yeast cdc27, p66, Is a Component of Active Human DNA Polymerase δ."J.Biochem.. In press. (2001)

Shikata, K.：“裂变酵母 cdc27，p66 的人类同源物是活性人类 DNA 聚合酶 δ 的一个组成部分。”J.Biochem. 正在出版（2001 年）。