複製フォーク複合体の形成とその制御機構の研究

1.WRNヘリカーゼ結合因子(WRNIP1)による複製フォーク進行制御ヒトWRNIP1はWRNヘリカーゼに結合するだけでなく、ヒトDNAポリメラーゼδと特異的に相互作用する。この因子の複製活性制御に係わる機能を明らかにするため、ヒトWRNIP1の発現系を構築し精製した。その結果、8量体複合体として振る舞い、DNAにより促進されるATPase活性を有した。またDNAポリメラーゼδの合成開始効率を上昇させることを明らかにした。さらに、この活性促進がATPase活性によって負に調節を受けることから、複製フォーク進行時に、DNA損傷を感知しながらDNA合成活性の制御を行っていることが示唆された。2.複製フォーク進行と染色体接着の連係機構の解析染色体接着に関与するChl12-RFC複合体が複製クランプPCNAの第2のローダーとして機能することを明らかにした。このことはPCNAクランプを介して複製フォークの進行と染色体接着反応が連係していることを意味する。さらに細胞の粗抽出液を使った反応系ではChl12-RFCによるPCNAローディングが見られないことから、細胞内ではPCNAローダーを使い分ける機構があることが考えられた。そこで、細胞抽出液を分画し、その特異性因子を検索し、Chl12-RFCによるPCNAローディングを抑制する因子と共に、Chl12-RFCによって特異的に促進を受けるDNAポリメラーゼ活性を見出した。3.ユビキチン化PCNAの精製と機能解析PCNAのユビキチン化がどのように複製フォーク進行制御に係わっているかを明らかにするため、最低1個のサブユニットが必ずユビキチン化されたPCNAを作成し、その機能変化を解析した。その結果、DNAローディング活性は影響を受けなかったが、PCNAの標的となるDNAポリメラーゼの中に活性が抑えられるものがあることが示された。

1.WRNヘリカーゼ結合因子(WRNIP1)による複製フォーク進行制御ヒトWRNIP1はWRNヘリカーゼに結合するだけでなく、ヒトDNAポリメラーゼδと特異的に相互作用する。この因子の複製活性制御に係わる機能を明らかにするため、ヒトWRNIP1の発現系を構築し精製した。その結果、8量体複合体として振る舞い、DNAにより促進されるATPase活性を有した。またDNAポリメラーゼδの合成開始効率を上昇させることを明らかにした。さらに、この活性促進がATPase活性によって負に調節を受けることから、複製フォーク進行時に、DNA損傷を感知しながらDNA合成活性の制御を行っていることが示唆された。2.複製フォーク進行と染色体接着の連係機構の解析染色体接着に関与するChl12-RFC複合体が複製クランプPCNAの第2のローダーとして機能することを明らかにした。このことはPCNAクランプを介して複製フォークの進行と染色体接着反応が連係していることを意味する。さらに細胞の粗抽出液を使った反応系ではChl12-RFCによるPCNAローディングが見られないことから、細胞内ではPCNAローダーを使い分ける機構があることが考えられた。そこで、細胞抽出液を分画し、その特異性因子を検索し、Chl12-RFCによるPCNAローディングを抑制する因子と共に、Chl12-RFCによって特異的に促進を受けるDNAポリメラーゼ活性を見出した。3.ユビキチン化PCNAの精製と機能解析PCNAのユビキチン化がどのように複製フォーク進行制御に係わっているかを明らかにするため、最低1個のサブユニットが必ずユビキチン化されたPCNAを作成し、その機能変化を解析した。その結果、DNAローディング活性は影響を受けなかったが、PCNAの標的となるDNAポリメラーゼの中に活性が抑えられるものがあることが示された。