脳機能解析に用いるノックアウトラットの開発

用于脑功能分析的基因敲除大鼠的开发

• 批准号: 15082211
• 负责人: 平林 真澄
• 金额: $ 35.33万
• 依托单位: National Institute for Physiological Sciences (2004-2007)Okazaki National Research Institutes (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15082211/
• 关键词: 核移植; クローンラット; 円形精子細胞; 生殖幹細胞; 遺伝子トラップ; ノックアウトラット; ROSI; 脱メチル化; インプリンティング; トランスジェニックラット; EGFP; 精子形成; 顕微授精; p34^<cdc2> kinase; 精原細胞; コンディショナルターゲッティング; Cre-loxP; dsRNAi法

脳機能解析に用いるためのノックアウトラット(KO)作製を目指し、これまでに体細胞クローン法と精子幹細胞を用いた方法を検討してきた。本年度は、(1)移植体細胞核の初期化動態をゲノムの脱メチル化を指標とした解析、(2)ラット由来GS細胞に遺伝子トラップし、遺伝子破壊が確認できたクローン由来の個体作製を行った。(1)脱メチル化を指標とした体細胞ドナー核の初期化の検討:移植体細胞核の初期化動態を調べることを目的に、DNAメチル化修飾の動態を調べた。胚発生の初期に起こる脱メチル化が初期化機構の一つであるという仮定のもと、まずラット受精卵における脱メチル化動態を調べた。交配後に受精卵を回収しメチル化量を調べたところ、受精から6〜10時間の間に急速にメチル化量が低下した。顕微授精(ICSI)で得た受精卵ではメチル化量の低下が受精卵を回収したものより僅かであった。ラットでは未受精卵を体外に取り出し操作することで、初期化機構の一つである脱メチル化能に影響を及ぼすことが明らかになった。(2)ラット精子幹細胞を用いた遺伝子改変個体の作製:遺伝子トラップ法により遺伝子導入したラット由来生殖幹細胞(GS細胞)をG418薬剤耐性により選択後、遺伝子破壊が確認できたクローンを免疫不全マウスの精巣内に移植し、半数体精子細胞精子へと分化させた。これによりできあがった円形精子細胞をラット卵子へ顕微授精(ROSI)し、遺伝子組換えラットを作製した。SD-EGFPラット由来およびWistar-EGFPラット由来の合計2トラップクローンで、それぞれ19匹および64匹の産仔が得られ、neoをプローブとしたサザン解析の結果、15匹および16匹(含未解析14匹)にneoのバンドが検出された。ホモ個体の作製と詳細な遺伝子解析は進行中だが、ラット精子幹細胞を用いることでKOラットを作製できることが明らかになった。

The machine can analyze the sperm cell by using KO as the target and the cell as the target. The sperm cell is used to analyze the sperm cell. This year, (1) the transplant has a preliminary nuclear response, and (2) the origin of the GS cell has been analyzed, and the cause of the disease has been confirmed. (1) desquamation refers to the primary activation of the nucleus of the implant, the primary activation of the nucleus of the implant, the modification of the nucleus of the implant, and the modification of the nucleus of the implant. the purpose of the transplant is to modify the nucleus of the implant. it is necessary to modify the nucleus of the implant. it is necessary to modify the nucleus of the implant. it is necessary to modify the nucleus of the implant. it is necessary to modify the nucleus. Starting from the early stage of embryo birth, the primary mechanism of embryo development is to treat the fertilized egg as soon as possible, so that the fertilized egg can be removed from the embryo. After mating, the number of fertilized eggs was significantly higher than that of fertilized eggs, and that of fertilized eggs was 6 to 10 hours after mating. Micro-insemination (ICSI) results in fertilized eggs with a low amount of fertilized eggs and low fertilized eggs. The in vitro extraction of unfertilized eggs was performed in vitro, and the preliminary chemical mechanism was used to determine the effect of the unfertilized oocytes on the in vitro extraction of unfertilized eggs. (2) after the selection of the G418 tolerance test in the GS cell, the sperm cell was confirmed to be immune incomplete sperm transplantation, and half of the somatic sperm were transplanted into the sperm cell. The spermatozoa were microfertilized (ROSI), and the sub-tissues were divided into sperm cells, sperm cells, sperm cells and sperm cells. The origin of SD-EGFP, the cause of the disease, the origin of the SD-EGFP, the cause of the disease, the origin of the SD-EGFP, the cause of the disease, the origin of the SD-EGFP, the cause of the disease, the cause of the disease In the process of analysis, the sperm cell of each individual is used to analyze the sperm cell, and the KO cell is used to analyze the data.

项目成果

ラットROSIにおいて新鮮精子細胞と凍結精子細胞のどちらを用いるかで卵活性化処理の適期が異なる

卵子激活治疗的最佳时机根据大鼠 ROSI 中使用的是新鲜还是冷冻精子细胞而有所不同。

• 发表时间: 2007
• 作者: 矢部光保;河野正男;八木裕之;斎尾浩一郎;Eimei Sato;Eimei Sato;Eimei Sato;Eimei Sato;Eimei Sato;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;佐藤英明;Hochi S;Hirabayashi M;Hirabayashi M;Hirabayashi M.;Iwanami Y.;Kaneko R.;金子 涼輔;保地 眞一;渡辺 香;加藤 めぐみ
• 通讯作者: 加藤 めぐみ

Kato M.: "Effect of activation regimens for rat oocytes on full-term development following round spermatid injection."Contem.Top.Lab.Anim.Sci.. 43(2). 10-12 (2004)

Kato M.：“大鼠卵母细胞激活方案对圆形精子细胞注射后足月发育的影响。”Contem.Top.Lab.Anim.Sci.. 43(2)。

The regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II during oocyte activation in the rat

• DOI: 10.1262/jrd.17047
• 发表时间: 2006-06-01
• 期刊: JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT
• 影响因子: 1.8
• 作者: Ito, Junya;Kaneko, Ryosuke;Hirabayashi, Masumi
• 通讯作者: Hirabayashi, Masumi

Live rats resulting from injection of oocytes with spermatozoa freeze-dried and stored for one year

• DOI: 10.1002/mrd.20825
• 发表时间: 2008-05-01
• 期刊: MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT
• 影响因子: 2.5
• 作者: Hochi, Shinichi;Watanabe, Kaori;Hirabayashi, Masumi
• 通讯作者: Hirabayashi, Masumi

Cloning in the rat. Health Consequences of Cloning / Progress in Pharmacology and Toxicology (Eds. Inui A)

在大鼠体内进行克隆。

• 发表时间: 2005
• 作者: Hirabayashi M.