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家族性筋萎縮性側索硬化症における変異SOD1特異的銅親和性の解析

家族性肌萎缩侧索硬化症突变型 SOD1 特异性铜亲和力分析

基本信息

批准号：
16015273
负责人：
長野清一
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16015273/
关键词：
筋萎縮性側索硬化症 SOD1 銅 CCS IMAC 蛍光X線分析

项目摘要

家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)でみられるCu, Zn-superoxide dismutase(SOD1)変異による発症機序として変異蛋白内の銅の関与が指摘されているが、その様態は不明である。SOD1活性部位への銅取り込みを司るcopper chaperone for SOD1(CCS)はFALS発症に関与しないことより、他の部位での異常銅結合が関与するものと推測されている。そこで我々はImmobilized metal affinity chromatography(IMAC)を用いて変異SOD1蛋白表面での銅親和性の変化を解析した。まず数種の変異SOD1マウス脊髄蛋白溶解液を用いて解析したところ、いずれの変異SOD1においても野生型SOD1よりも銅親和性が上昇していた。次に数種の変異SOD1発現酵母を培養し、その蛋白溶解液で同様にIMACを行ったところ、変異蛋白の銅親和性の上昇が確認された。内因性CCS欠損酵母株を用いた検討でも同様の結果が得られ、この親和性の上昇が活性部位への銅取り込みとは無関係であることが示された。次に変異SOD1のみを保持する条件でIMACカラム内蛋白をトリプシン消化し、SOD1内銅親和性責任ペプチド断片を分離、質量分析によりその候補としてアミノ酸残基10-23番目に相当する断片が同定された。さらに変異SOD1マウス脊髄におけるニューロン・グリア細胞内SOD1陽性凝集体の銅含量を蛍光X線分析により測定したが、どの部位でも同方法による検出感度以下であり、凝集体内銅集積の証明には至らなかった。

Cu, Zn-superoxide dismutase(SOD1) changes in familial amyotrophic lateral sclerosis (FALS), and the mechanism of development is unclear. The copper chaperone for SOD1(CCS) is associated with the development of FALS and with abnormal copper binding in other sites. Immobilized metal affinity chromatography(IMAC) was used to analyze the copper affinity of SOD1 protein. The copper affinity of several different SOD1 species was increased by the use of the protein lysates. Several different SOD1-producing yeasts were cultured in different protein lysates, and the copper affinity of different proteins was increased. The results showed that the affinity of CCS-deficient yeast strains was increased, and the activity of CCS-deficient yeast strains was decreased. In addition, under different conditions of SOD1 retention, the protein in IMAC domain was digested, and the copper affinity responsible fragment in SOD1 was isolated and mass analyzed. The corresponding fragments of acid residues 10-23 were identified. The copper content of SOD1-positive aggregates in cells was determined by X-ray analysis. The results showed that the copper accumulation in aggregates was proved by the same method.