ヒト赤血球膜タンパク質Band3膜貫通ドメインの電子線結晶構造解析

人红细胞膜蛋白Band3跨膜结构域的电子晶体结构分析

• 批准号: 16048224
• 负责人: 山口 知宏
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048224/
• 关键词: 二次元結晶化; 再構成; DTAC

本研究は外向き型/内向き型Band3膜貫通ドメイン(MD)の構造を二次元結晶化及び電子線結晶学に基づいて解き、これらを比較することによってアニオン透過機構の全容解明を目的とした。H_2-DIDS結合型/外向き型Band3MDの二次元結晶化を透析法によって行った結果、界面活性剤に0.1%C_<12>E_8を、リン脂質にDOPC:PS(100:1、LPR=0.24-0.28)を用い、透析外液(10mM Tris,pH7.0,100mM NaCl,1mM MgCl_2,1% PEG200,0.02% NaN_3)に対して25℃で透析を行うことにより、再現性のよい二次元結晶形成が可能になった。この結晶はリン脂質ベシクルの直線的な縁に沿って存在し、その幅は狭い(100nm)ものであった。さらにバクテリオドプシンの結晶融合法を応用し、結晶試料にカチオン性界面活性剤DTACを添加することによって、Band3MDでも二次元結晶の融合に成功した。また、この結晶融合試料にL-リジンを添加することによって結晶成長が観察された。当初目標であった構造解析に耐える結晶形成までに至らず、電子線結晶構造解析ができなかった。またH_2-DIDS結合型Band3MDの結晶化に手間取り、DEPC結合型/内向き型の結晶化に着手できなかった。しかしBand3MDのリン脂質膜への再構成功率を維持しつつ小結晶を効率よく形成させた後、DTACによる結晶融合とその後の結晶成長が可能になったことから、一般的な結晶化の手法である透析法だけでは難しかったBand3DMの二次元結晶化条件検討のスピードアップが期待できる。

In this study, the structure of the outward/inward Band3 film penetration membrane (MD) was studied. The structure of MD was characterized by two-dimensional crystallization and electron ray crystallization. H_2-DIDS bound/extroverted Band3MD secondary crystallization was studied by dialysis method. The results showed that 0.1% C_E_8 <12>and 0.24-0.28 of DOPC:PS(100:1, LPR=0.24-0.28) were used in the dialysis solution. The dialysis solution (10mM Tris, pH 7.0, 100 mM NaCl,1mM MgCl_2, 1% PEG200, 0.02% NaN_3) was suitable for dialysis at 25℃. The crystals are in a straight line and have a narrow amplitude (100nm). The crystal fusion method of the crystal sample was successfully applied to the crystal sample with the addition of DTAC, and the fusion of Band3MD was successfully performed. The crystal fusion sample was added to the sample and the crystal growth was observed. The original purpose of the structure analysis is to resist the formation of crystals, and the electron line crystal structure analysis is to resist the formation of crystals. The crystallization of H_2-DIDS bonded Band3MD was started by hand, and the crystallization of DEPC bonded Band 3 MD was started by hand. The reconstruction power of the lipid film of Band3MD is maintained. After the formation of small crystals, the crystal fusion of DTAC and the subsequent crystal growth are possible. The general crystallization method is difficult to analyze the quadratic crystallization conditions of Band 3 DM.