セミインタクト細胞系を用いたアグリソーム形成機構の可視化解析

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細胞内コレステロール排出活性を持つABCタンパク質ABCA1の一アミノ酸置換変異体ABCA1-QRは通常は小胞体に留まったままだが、小胞体ストレスに敏感に反応して小胞体を離脱し形質膜へと輸送されることを見出した。実際、ABCA1-QR-GFPを恒常的に発現しているstable transfectant(HEK-QR)に小胞体ストレス(DTT処理又はタプシガルジン処理など)を負荷したところ、小胞体に蓄積していたQR-GFPはおおよそ30分以内で核周縁領域に移行し蓄積する様子が観察された。つまり、小胞体に蓄積しERAD経路を取って分解されていたQR-GFPは、小胞体ストレス負荷により通常の小胞輸送経路を取って細胞形質膜へと輸送されるており、同一の膜タンパク質が小胞体内でERAD経路と小胞輸送経路を選別しうることが明らかとなった。そこで、申請者は小胞体ストレス依存的なQR-GFPの小胞体からの輸送に関わるキナーゼの網羅的同定を試みた。始めに20種類のキナーゼ阻害剤をHEK-QRに作用させた上で小胞体ストレスを負荷し、ジアシルグリセロールキナーゼおよびGSK3beta阻害剤などによって輸送が阻害されることを明らかにした。さらに、阻害剤の結果に基づいて当研究室が保持する細胞チップ自動作成装置を用いて網羅的キナーゼRNAiを行い、数種類のキナーゼが小胞体ストレス依存的なABCA1-QRの輸送に関与することを見つけた。今後はこのキナーゼ群の関与の確認、および詳細な分子メカニズムの同定を行う予定である。