セミインタクト細胞を用いたオルガネラの形態形成とそのダイナミクスの分子機構の解明

使用半完整细胞阐明细胞器形态发生及其动力学的分子机制

• 批准号: 02J03970
• 负责人: 加納 ふみ
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The University of Tokyo (2003)Okazaki National Research Institutes (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J03970/
• 关键词: セミインタクト細胞; GFP; 小胞体; 細胞周期; オルガネラ; 可視化; 再構成; 細胞生物学

哺乳動物細胞の小胞体(endoplasmic reticulum, ER)は、間期では細胞中に広がった連続した網目構造を構築している。この細胞内でつながって一つに連続している小胞体が細胞分裂期にどのような機構で娘細胞へと分配されるかを、小胞体の可視化とその動態追跡により明らかにした。まず、小胞体に局在するシャペロンであるHSP47とGFPの融合タンパク質を恒常的に発現するCHO細胞株(CHO-HSP)を樹立し、小胞体を可視化した。共焦点レーザー顕微鏡観察やFLIP(fluorescence loss in photobleaching)法といった分光学的手法を用いた実験より、小胞体は細胞分裂時でも連続であること、しかしERチューブが部分的に切断されることによりそのダイナミクスが間期のときに比べて増大していることなどがわかった。そこで形質膜を透過性にしたセミインタクト細胞系を用いて、ERに特異的な網目構造を変化させる因子を生化学的に探索する系を確立した。セミインタクト細胞は連鎖球菌毒素ストレプトリシンOをCHO-HSP細胞に作用させ、形質膜に直径約30nmの穴をあけることにより調製した。セミインタクトCHO-HSP細胞にL5178Y細胞により調製した間期/M期細胞質をATP再生系とともに添加した後、ERの形態学的変化を光学顕微鏡観察し、three-way Junction assayによる定量化(ある一定範囲内のERの三つ又構造の数をカウントする方法)を行った。その結果、微小管がノコダゾール処理により破壊されているときに限り、M期細胞質によってERの網目構造が破壊されることなどを明らかにすることができた。また、M期細胞質によるERの網目構造の破壊は、Cdc2キナーゼに依存することもわかった。そのターゲットを探索した結果、homotypicな膜融合を制御するp97のコファクターp47がM期においてCdc2キナーゼによってリン酸化され機能が失われることが重要であることを明らかにした。これらの結果はまとめ、現在論文投稿中である。またM期細胞質によって壊れたERの網目構造は新たに間期細胞質を加えることによって再構築されうることがわかり、その細胞質因子の同定を進めている。

The endoplasmic reticulum (ER) of mammalian cells is constructed in the middle of the cell. In this way, the cells can be divided into two parts: cell division, and cell division. CHO cell lines (CHO-HSP) were established and microsomes visualized in the presence of HSP47 and GFP fusion proteins. FLIP(fluorescence loss in photolaching) method is used to detect the micro-focal point. When the cell divides, it is connected to the cell. When the cell divides, the part of the cell is cut off. A cell line with membrane permeability, ER specific mesh structure, and biochemical characteristics was established. The cell membrane of CHO-HSP cells was modulated by a hole about 30nm in diameter. The morphological changes of ER in CHO-HSP L5178Y cells were observed by optical microscopy and quantified by three-way Junction assay after addition of ATP regeneration system in the cytoplasm of CHO-HSP cells. As a result, the microtubule was treated in a manner that allowed it to be isolated from the cytoplasm of the M phase ER. The structure of ER mesh in M and M phases depends on the structure of Cdc2. The results of the exploration, homotypic membrane fusion control, p97, p47, p47, p4これらの结果はまとめ、现在论文投稿中である。The structure of the M phase cytoplasm and the structure of the ER mesh are new, and the structure of the M phase cytoplasm and the structure of the ER mesh are new.

项目成果

Uchiyama, K.: "VCIP135, a novel essential factor for p97/p47-mediated membrane fusion, is required for Golgi and ER assembly in vivo"Journal of Cell Biology. 159・5. 855-866 (2002)

Uchiyama, K.：“VCIP135 是 p97/p47 介导的膜融合的新型必需因子，是体内高尔基体和 ER 组装所必需的”《细胞生物学杂志》159·5 (2002)。

Uchiyama, K.et al.: "The localization and phosphorylation of p47 are important for Golgi disassembly-assembly during the cell cycle"J.Cell Biol.. 161 6. 1067-1079 (2003)

Uchiyama, K. 等人：“p47 的定位和磷酸化对于细胞周期中高尔基体的分解组装非常重要”J.Cell Biol.. 161 6. 1067-1079 (2003)

Tanaka, AR.: "Effects of Mutations of ABCA1 in the First Extracellular Domain on Subcellular Trafficking and ATP binding/hydrolysis"Journal of Biological Chemistry. 278・10. 8815-8819 (2003)

Tanaka, AR.：“第一胞外结构域中的 ABCA1 突变对亚细胞运输和 ATP 结合/水解的影响”《生物化学杂志》278・10（2003 年）。

Yuasa-Kawada, J.et al.: "Axonal morphogenesis controlled by antagonistic roles of two CRMP subtypes in microtubule organization"Eur.J.Neurosci.. 17 11. 2329-2343 (2003)

Yuasa-Kawada, J.et al.：“微管组织中两种 CRMP 亚型的拮抗作用控制轴突形态发生”Eur.J.Neurosci.. 17 11. 2329-2343 (2003)

Nadanaka, S.et al.: "Activation of Mammalian Unfolded Protein Response Is Compatible with the Quality Control System Operating in the Endoplasmic Reticulum."Mol.Biol.Cell. (In press). (2004)

Nadanaka, S.等人：“哺乳动物未折叠蛋白反应的激活与内质网中运行的质量控制系统兼容。”Mol.Biol.Cell。