液中高速原子間力顕微鏡による分子シャペロンの1分子反応機構解析

利用液基高速原子力显微镜分析分子伴侣的单分子反应机理

• 批准号: 17028031
• 负责人: 吉村 成弘
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17028031/
• 关键词: シャペロニン; 原子間力顕微鏡; 1分子イメージング; 反応速度論; 原子間力顕微鏡(AFM); 分子シャペロン; 高速AFM; 1分子観察

シャペロニンは、タンパク質のフォールティングを介助する分子シャペロンの一群であり、全ての生物において必須の役割を担っている。シャペロニンは、ATP加水分解を介したダイナミックな構造変化により、変性状態の基質タンパク質を自身の内部空洞に取り込み、そのフォールディングを介助することが知られている。しかし、このフォールディング反応の詳細な過程(ATPの結合・加水分解・解離にともなう構造変化等)に関しては、未解明の部分が多い。本研究課題では、新規に開発された高速走査型原子問力顕微鏡(高速AFM)を用いて、大腸菌のシャペロニンGroELのヌクレオチド依存的構造変化を一分子レベルでリアルタイムに可視化・解析する技術を確立し、以下の成果を得た。1.高速AFMを用いて、5フレーム毎秒の速度で溶液中のGroEL一分子を観察する系を確立した。2.ヌクレオチドの結合によるGroELの構造変化(open型とclosed型)、および、GroESのGroELへの結合解離反応を観察することに成功し、それらの反応速度定数等を得た。3.GroELはヌクレオチド(ATP, ADP, ATP-γ-S, AMP-PNP, ADP+AlFxなど)存在下でopen型とclosed型の間で構造変化を繰り返していること、この構造変化はミリ秒以下の速度で起こること、ATP加水分解のエネルギーを直接必要としないことを明らかにした。4.ヌクレオチドが結合したopen型GroELの構造安定性を調べると、ADP結合型の方がATP結合型よりも不安定であること、ATPの加水分解により構造が不安定化することがわかった。こうした結論は、以前に提唱された"2 timer mechanism"におけるタイマーの一つが、GroEL cis-ring内におけるATPの加水分解である可能性を強く示唆するものと考えられる。5.同様の手法を用いて、グループII型シャペロニン(細胞質シャペロニンCCT、超好熱性古細菌(Thermococcus sp.KS-D由来シャペロニン)の観察を行い、その構造変化を示す初期データを得た。

A group of molecules that are involved in the production of biological products must be involved in the production of biological products In addition, the structure of ATP is changed, and the matrix is changed. In addition, the structure of ATP is changed. The detailed process of ATP reaction (ATP binding, hydrolysis, dissociation, structural transformation, etc.) is related to the unexplained part. This research project aims to develop a new technique for the application of high-speed atomic force microscopy (AFM), to establish a molecular visualization and analysis technology for the structural transformation of Escherichia coli and to develop a new method for the visualization and analysis of Escherichia coli. 1. High speed AFM is used to establish a system for detecting GroEL molecules in solution at a speed of 5 seconds. 2. The structural transformation (open type and closed type) of GroEL, the detection of the dissociation reaction of GroEL, the determination of the reaction velocity of GroEL, etc. 3. In the presence of GroEL (ATP, ADP, ATP-γ-S, AMP-PNP, ADP+AlFx), the structural transformation between open type and closed type starts at a speed below a second, and the ATP hydrolysis starts at a speed directly necessary. 4. Structural instability of the open type GroEL, ATP binding type GroEL and ATP hydrolysis type GroEL. The conclusion is that the possibility of ATP hydrolysis in the GroEL cis-ring is strong. 5. The same method was used to detect the early stage of the evolution of the structure of Thermococcus sp. KS-D, Cytoplasmic Type II, CCT and Thermococcus sp. KS-D.

项目成果

Development of glutathione-coupled cantilever for the single-molecule force measurement by scanning force microscopy

• DOI: 10.1016/j.febslet.2006.06.032
• 发表时间: 2006-07-10
• 期刊: FEBS LETTERS
• 影响因子: 3.5
• 作者: Yoshimura, Shige H.;Takahashi, Hirohide;Takeyasu, Kunio
• 通讯作者: Takeyasu, Kunio

Topoisomerase II, scaffold component, promotes chromati compaction in vitro in a linker-histone H1-dependent manner.

拓扑异构酶 II（支架成分）以连接组蛋白 H1 依赖性方式促进体外染色质压缩。

• 发表时间: 2007
• 期刊: Nucleic Acid Res. 35・8
• 作者: 監修:石原得博;編集:池田修一;著者:樋口京一;S.H.Yoshimura 他;K.Hizume 他
• 通讯作者: K.Hizume 他

Comparative structural biology of the genome : Nano-scale imaging of single nucleus from different kingdoms reveals the chromatin built up

基因组的比较结构生物学：来自不同界的单核的纳米级成像揭示了染色质的形成

• 发表时间: 2006
• 期刊: J.Electr.Microsc. 55・1
• 作者: 監修:石原得博;編集:池田修一;著者:樋口京一;S.H.Yoshimura 他;K.Hizume 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他
• 通讯作者: S.H.Yoshimura 他

Fast-scanning atomic force microscopy revealed the molecular mechanism of DNA cleavage by Anal endonuclease.

快速扫描原子力显微镜揭示了 Anal 核酸内切酶切割 DNA 的分子机制。

• 发表时间: 2006
• 期刊: IEE Proc.Nonobiotech. 153・4
• 作者: 監修:石原得博;編集:池田修一;著者:樋口京一;S.H.Yoshimura 他;K.Hizume 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他
• 通讯作者: S.H.Yoshimura 他

Comparative structural biology of the genome : Nano-scale imaging of single nucleus from different kingdoms reveals the chromatin built up on a 40 nm

基因组的比较结构生物学：来自不同界的单核的纳米级成像揭示了建立在 40 nm 上的染色质

• 发表时间: 2006
• 期刊: Journal of Electron Microscopy (印刷中)
• 作者: 監修:石原得博;編集:池田修一;著者:樋口京一;S.H.Yoshimura 他;K.Hizume 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他;S.H.Yoshimura 他
• 通讯作者: S.H.Yoshimura 他