液中高速原子間力顕微鏡による分子シャペロンの1分子反応機構解析

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シャペロニンは、タンパク質のフォールティングを介助する分子シャペロンの一群であり、全ての生物において必須の役割を担っている。シャペロニンは、ATP加水分解を介したダイナミックな構造変化により、変性状態の基質タンパク質を自身の内部空洞に取り込み、そのフォールディングを介助することが知られている。しかし、このフォールディング反応の詳細な過程(ATPの結合・加水分解・解離にともなう構造変化等)に関しては、未解明の部分が多い。本研究課題では、新規に開発された高速走査型原子問力顕微鏡(高速AFM)を用いて、大腸菌のシャペロニンGroELのヌクレオチド依存的構造変化を一分子レベルでリアルタイムに可視化・解析する技術を確立し、以下の成果を得た。1.高速AFMを用いて、5フレーム毎秒の速度で溶液中のGroEL一分子を観察する系を確立した。2.ヌクレオチドの結合によるGroELの構造変化(open型とclosed型)、および、GroESのGroELへの結合解離反応を観察することに成功し、それらの反応速度定数等を得た。3.GroELはヌクレオチド(ATP, ADP, ATP-γ-S, AMP-PNP, ADP+AlFxなど)存在下でopen型とclosed型の間で構造変化を繰り返していること、この構造変化はミリ秒以下の速度で起こること、ATP加水分解のエネルギーを直接必要としないことを明らかにした。4.ヌクレオチドが結合したopen型GroELの構造安定性を調べると、ADP結合型の方がATP結合型よりも不安定であること、ATPの加水分解により構造が不安定化することがわかった。こうした結論は、以前に提唱された"2 timer mechanism"におけるタイマーの一つが、GroEL cis-ring内におけるATPの加水分解である可能性を強く示唆するものと考えられる。5.同様の手法を用いて、グループII型シャペロニン(細胞質シャペロニンCCT、超好熱性古細菌(Thermococcus sp.KS-D由来シャペロニン)の観察を行い、その構造変化を示す初期データを得た。