アフリカツメガエル卵母細胞単離卵核を用いた核膜トポロジーの解析

核の内と外は単に脂質膜構造によって仕切られているだけではなく、核膜孔複合体のトポロジー、ラミンネットワーク、染色体、Ran-GTP/GDPの濃度勾配、核移行・核外移行などによってもたらされる複雑かつ動的な非対称構造を持つ。申請者はこの複雑なトポロジー形成機構を理解するため、生化学的解析に適した特殊性を持つアフリカツメガエル卵母細胞単離卵核を、細胞内におけるin vivo環境と精製分子によるin vitro境の中間に位置する新たな実験系として用い細胞核の機能を探っている。平成18年度は以下の研究を行った。1「核内膜蛋白質の局在機構の解析」新規分子を含めた多数のアフリカツメガエル核内膜蛋白質群について、EGFP融合組換え蛋白質をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させる系を構築したが、発現効率が低く詳細な解析ができなかった。そのため本年度は内在性蛋白質を検出する抗体の作成を行い、多くの核内膜蛋白質に対して特異性の高い抗体を得た。今後はこれらの抗体を用いて詳細な解析を進める予定である。2「核内に閉じ込められた核外移行蛋白質の挙動の解析」オイル中で単離した卵核は核内の物質を核外に排出できない。EGFPのC末端にHIV Rev蛋白質の核外移行配列を付加した組換え蛋白質(EGFP-NES)や、細胞質型Ran変異体(GDP-Ran T24N)をオイル中で単離した卵核内へ直接注入したところ、核の断片化が見られた。核外移行分子の強制的な核内局在は核の機能を障害すると推測され、その分子機構について解析している。3「アフリカツメガエル卵核におけるactinの機能」アフリカツメガエル卵核中心部では、細胞骨格蛋白質であるactinが生理的条件下で重合しコア構造を形成していること、またこのコア構造が核小体の核内辺縁部への正しい配置に必要であることを見出した。

核の内と外は単に脂質膜構造によって仕切られているだけではなく、核膜孔複合体のトポロジー、ラミンネットワーク、染色体、Ran-GTP/GDPの濃度勾配、核移行・核外移行などによってもたらされる複雑かつ動的な非対称構造を持つ。申請者はこの複雑なトポロジー形成機構を理解するため、生化学的解析に適した特殊性を持つアフリカツメガエル卵母細胞単離卵核を、細胞内におけるin vivo環境と精製分子によるin vitro境の中間に位置する新たな実験系として用い細胞核の機能を探っている。平成18年度は以下の研究を行った。1「核内膜蛋白質の局在機構の解析」新規分子を含めた多数のアフリカツメガエル核内膜蛋白質群について、EGFP融合組換え蛋白質をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させる系を構築したが、発現効率が低く詳細な解析ができなかった。そのため本年度は内在性蛋白質を検出する抗体の作成を行い、多くの核内膜蛋白質に対して特異性の高い抗体を得た。今後はこれらの抗体を用いて詳細な解析を進める予定である。2「核内に閉じ込められた核外移行蛋白質の挙動の解析」オイル中で単離した卵核は核内の物質を核外に排出できない。EGFPのC末端にHIV Rev蛋白質の核外移行配列を付加した組換え蛋白質(EGFP-NES)や、細胞質型Ran変異体(GDP-Ran T24N)をオイル中で単離した卵核内へ直接注入したところ、核の断片化が見られた。核外移行分子の強制的な核内局在は核の機能を障害すると推測され、その分子機構について解析している。3「アフリカツメガエル卵核におけるactinの機能」アフリカツメガエル卵核中心部では、細胞骨格蛋白質であるactinが生理的条件下で重合しコア構造を形成していること、またこのコア構造が核小体の核内辺縁部への正しい配置に必要であることを見出した。