単一細胞マイクロアレイのためのサイトカイン実時間精密計測技術

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本研究では種々の環境変化の下でリンパ球が放出するインターロイキン2(IL-2)のようなサイトカインを単一細胞レベルで検出することを究極の目的として、まず高解像度2次元SPR免疫センサを高感度化するためにセンサチップ構造、測定条件、信号増幅手法などあらゆる視点から検討する。そして抗サイトカイン抗体を固定化して、これまで例がないウェル径10〜30μmという極微小空間におけるサイトカインの測定を可能にする。本年度は2次元SPRイメージング免疫センサの高感度化を中心に研究を行った。まず高感度化のために測定条件の検討をおこなった。取得画像品質に影響する露光時間、光源強度、光源波長などや、輝度変化を測定する角度を最適化したところ従来に比べ約20倍高感度化することができた。さらにSPR免疫センシングの感度を著しく向上させるために、ウェスタンブロッティング法を応用して、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いたクロロナフトールの沈殿反応を利用した信号増幅を導入した。その結果、0.1μg/mlマウスIgGに対して従来法での10μg/mlマウスIgGに対する応答の約5倍の応答値が得られ、数百倍の感度の増大が実現できた。そこで、サイトカインとしてIL-2を選び、2次元SPRイメージングセンサのセンサ薄膜上にタンパク質の非特異的な吸着を抑制するためにポリエチレングリコールの自己集積化膜を介して、抗IL-2抗体を固定化し、IL-2のSPRによる検出を行った。