極短パルスレーザーを用いた細胞内局在性タンパク質作用因子の取得とその網羅的解析

近年、細胞間あるいは、細胞内情報伝達やこれに関わる各種生理作用物質の研究が、モレキュラーレベルで論じられるようになってきた。これらの研究は主に、組織や個体を用いたミュータントのフェノタイプの観察あるいは、関連分子のバルク調製による生化学的相互作用の解析に基づいたものがほとんどであるが、より正確で、直接的な知見を得るためには、バルクでの観測ではなく、個々の細胞で実際に起こっている情報伝達をオンサイトで観測し、そこで作用している物質を直接同定することが望ましいことは、言うまでもない。本研究では、細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質の細胞内での作用機作の解明、および、常染色体劣性遺伝の疾患の一種、ロバーツ症候群の原因核局在性遺伝子産物の細胞内での作用機作の解明を題材に取り上げ、細胞微細加工技術および、超微量生体物質分析技術を用いて、これらの分子のカウンターパートとなる、ホスト細胞由来相互作用因子の直接同定を試み、当該分野に新知見をもたらすと共に、1細胞を基盤としたライフサーベイヤ研究の重要性を指し示すことを目的としている。H18年度は、(1)極短パルスレーザーを用いたサブセルラーサンプリング装置のセットアップ、(2)GFP融合アミロイド蛋白質毒素TDH(腸炎ビブリオ由来)発現細胞の調製、(3)GFP融合ESCO2蛋白質発現細胞の調製、(4)サブセルラーマイクロサンプリングによる相互作用する蛋白質の取得を検討し、フェムト秒レーザーを用いたサブセラーミクロディセクションによって、GFP標識した細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質を切り出すことに成功した。また、微量分析技術として、PCRとLC-MSを組み合わせた新しい転写産物の分析法を確立した。

近年、細胞間あるいは、細胞内情報伝達やこれに関わる各種生理作用物質の研究が、モレキュラーレベルで論じられるようになってきた。これらの研究は主に、組織や個体を用いたミュータントのフェノタイプの観察あるいは、関連分子のバルク調製による生化学的相互作用の解析に基づいたものがほとんどであるが、より正確で、直接的な知見を得るためには、バルクでの観測ではなく、個々の細胞で実際に起こっている情報伝達をオンサイトで観測し、そこで作用している物質を直接同定することが望ましいことは、言うまでもない。本研究では、細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質の細胞内での作用機作の解明、および、常染色体劣性遺伝の疾患の一種、ロバーツ症候群の原因核局在性遺伝子産物の細胞内での作用機作の解明を題材に取り上げ、細胞微細加工技術および、超微量生体物質分析技術を用いて、これらの分子のカウンターパートとなる、ホスト細胞由来相互作用因子の直接同定を試み、当該分野に新知見をもたらすと共に、1細胞を基盤としたライフサーベイヤ研究の重要性を指し示すことを目的としている。H18年度は、(1)極短パルスレーザーを用いたサブセルラーサンプリング装置のセットアップ、(2)GFP融合アミロイド蛋白質毒素TDH(腸炎ビブリオ由来)発現細胞の調製、(3)GFP融合ESCO2蛋白質発現細胞の調製、(4)サブセルラーマイクロサンプリングによる相互作用する蛋白質の取得を検討し、フェムト秒レーザーを用いたサブセラーミクロディセクションによって、GFP標識した細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質を切り出すことに成功した。また、微量分析技術として、PCRとLC-MSを組み合わせた新しい転写産物の分析法を確立した。