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鉄ニッケル型ヒドロゲナーゼの金属クラスター形成における構造生物学的研究

铁镍氢化酶金属簇形成的结构生物学研究

基本信息

批准号：
18054029
负责人：
庄村康人
金额：
$ 2.11万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では水素分子の酸化を可逆的に触媒するヒドロゲナーゼのNiFeクラスター活性中心形成過程に関与する,HypEとHypFが触媒するカルバモイルリン酸からニトリル基を合成する反応機構の解明を目指している.昨年度までは,硫酸還元菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough由来のタンパク質試料を用いて実験を行い,ヌクレオチド結合型,非結合型それぞれにおいてHypE単体の結晶構造決定に成功していたが,活性のあるHypFタンパク質試料の調整が困難であることが判明していた.そこで今年度は,大腸菌由来HypE,HypFタンパク質の調整を試みた.アフィニティークロマトグラフィー等による精製後のタンパク質は硫酸還元菌由来のものとは異なり,両者の間には有意な相互作用が見られ,さらにHypFによるHypEへのカルバモイル化反応も確認できた.HypEF複合体をゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の手法により分析したところ,(HypE)_2(HypF)_2の量比を示唆する結果が得られ,高純度の複合体試料を得ることに成功している.また,全長HypF単体の結晶化は困難であることがこれまでに分かっているため,結晶化に適したコンストラクト作製にも着手しており,その結果,幾つかの有力な発現系が得られた.これらの発現系は,結晶化だけでなく,HypEとHypFの相互作用様式および反応機構の解明にも大いに役立つことが期待される.

In this study, we aim to elucidate the mechanism of reversible acidification of H2O molecules, which is related to the formation of NiFe active sites and the synthesis of H2O and H2O active sites. Last year, Desulfovibrio vulgaris Hildenborough was successfully used in the determination of the crystal structure of HypE monomer, and the adjustment of the activity of HypE monomer was difficult. This year, E. coli is derived from HypE,HypF, and the quality of the product is adjusted. HypF complex was identified by the method of analysis, and the ratio of (HypE)_2(HypF)_2(HypF)_2) was determined. High purity complex samples were successfully obtained. Crystallization of the full-length HypF monomer is difficult, crystallization is suitable for the production process, and the result is a powerful development system. This phenomenon is due to crystallization,HypE and HypF interaction model and reaction mechanism.