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G蛋白質によるイオンチャンネルの調節機構:1分子イメージング解析

G蛋白对离子通道的调节机制：单分子成像分析

基本信息

批准号：
18057029
负责人：
額田敏秀
金额：
$ 3.52万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

Gサイクルにおける,Ca<^2>+チャンネルに対する制御機構の時間・空間的解明に向けて,蛍光蛋白質で標識したG蛋白質Goα(CFP-Goα)とN型Ca^<2+>チャンネルαlBサブユニット(α1B-YFP)を用いて,以下の知見を得た。1.CFP-GoαとαlB-YFPとの共発現細胞で,G蛋白質共役型受容体(GPCR)刺激により,YFP/CFPの蛍光強度比の増強が蛍光顕微鏡観察で確認でき,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)現象を通じてGoαとα1Bの相互作用が確認できた。2.CFP-Goα,α1B-YFPを発現させた培養細胞の全反射蛍光顕微鏡観察により,1段階消光が確認でき,1分子の挙動が確認可能となった。3.GPCR刺激により,Goαとα1Bの1分子軌跡の動きに一過性の抑制が見られた。即ち,刺激後3分付近で最もその動きが抑えられ(50-60%抑制),10分程度で刺激前の状態に回復した。α1B-YFPの動きの回復は,CFP-Goαに比べて多少早い傾向がみられたが,動きが最も抑制される3分付近で両者が相互作用する確率が高いことが示唆された。1分子FRETの同定には,エネルギーが移動したacceptor蛍光タンパク質の蛍光強度が鍵を握る。CFP(またはCyPet)-YFP(またはYpet)の組み合わせでは,CFPの励起光の波長がGFPに比べて紫外側にあり,そのため細胞の自家蛍光も増加し,S/N比が減少する傾向にあった。従って,1.の多分子間のFRETは捕捉できるが,1分子FRETの確認は困難であった。そのため,複数の蛍光タンパク質の組み合わせや変異体の作製も試みたが,EGFPと平成19年夏に報告された現在のところ最も強い赤色蛍光を発するTagRFPとの組み合わせが最有力であった。これらを使用して,TagRFP/GFPの蛍光強度比の変化を指標として1分子計測を行い,両者の相互作用を検討した。

G protein is identified by the use of G protein Goα(CFP-Goα) and N-type Ca^<2 +>,Ca<2+>, Ca <3 +>, Ca <3 + 1.CFP-Goα and α 1B-YFP co-expression in cells stimulated by GPCR, the increase of the fluorescence intensity ratio of YFP/CFP was confirmed by microscopic examination, and the interaction between CFP-Go α and α1B was confirmed by FRET. 2.CFP-Goα,α1B-YFP was detected by total reflection microscopy in cultured cells. The first order extinction was confirmed, and the first molecular motion was confirmed. 3. Transient inhibition of GPCR-induced activation of α_1B_1 molecule was observed. 3 minutes after stimulation, the most active state was inhibited (50-60% inhibition), and 10 minutes after stimulation, the most active state was restored.α1B-YFP's motion and recovery are different,CFP-Goα tends to be earlier than α 1B-YFP's motion and more accurate than α 1B-YFP's motion and interaction. 1 Molecular FRET is constant, and the acceptor is constant, and the acceptor is constant. The CFP(CyPet)-YFP(YPet) combination tends to increase the excitation wavelength of CFP compared to GFP on the ultraviolet side, and the S/N ratio tends to decrease.従って,1.の多分子间のFRETは捕捉できるが,1分子FRETの确认は困难であった。In the summer of 1999, the report of the most powerful group of red light was published. In this case, the change of the fluorescence intensity ratio of TagRFP/GFP is an indicator of molecular measurement and interaction between them.