細胞内オルガネラにおける糖鎖修飾機構解明をめざしたゴルジ機能ミミックの創製

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一連の研究成果としてマイクロチップ上で二基質型酵素である糖転移酵素のタ段階(3段階)反応を達成し、論文発表、新聞上でのプレスリリースをおこなった。さらに本年度は、細胞内でおこっているスフィンゴ糖脂質の合成過程を分子レベルで時空間定量解析するための二つの基礎研究を行った。すなわち、1) in vivoの実験系における糖脂質合成の解析に向けて細胞培養をおこない、合成脂質プローブを導入して時空間分解解析を行った。また、2) in vitro、および、in vivoにおける実験から得られる糖脂質混合物の分析を達成するために低拡散ナノLCをフローセルを用いずにオンラインで蛍光検出し、さらにそのままオンラインでナノスプレーESIを行い質量分析をおこなう装置を開発した。1)プローブは、蛍光タグを導入したラクトシルセラミドアナログと安定同位体標識したアナログを合成し用いた。後者は、質量分析条件下で内在性の糖脂質と判別が可能となるよう重水素の数を選定した。合成したラクトシルセラミドアナログについてシアル酸転位反応を行い有用性の確認をした。共焦点顕微鏡を用い時空間分解可視化もおこない、蛍光の時間依存性を解析した。この過程は、糖鎖合成を伴う蛍光糖脂質の小胞、ゴルジ体、分泌小胞における局在解析であり、今後のゴルジ体における糖鎖合成制御機構の解明に向けて重要な基礎となる。世界的にも取り組まれていない先端研究である。2) in vitro、および、in vivoにおける実験から得られる糖脂質混合物の微量定量的構造解析を行うために、ナノLC-蛍光検出-ナノスプレーイオン化-MS/MS分析をオンラインで可能とする装置の構築を達成した。本年度は特に、光ファイバーを用いる光学系を構築し高感度化とダイナミックレンジの向上を達成できた。このようにして今後のin vitro、および、in vivoにおける実験から得られる糖脂質混合物の微量定量的構造解析に必須となる解析装置を構築した。