タンパク質膜透過システムの一分子計測

蛋白质膜渗透系统的单分子测量

• 批准号: 19042014
• 负责人: 森 博幸
• 金额: $ 4.1万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042014/
• 关键词: 一分子計測; SecA; SecYEG; translocon; タンパク質膜透過; ATPase; 平面膜; 再構成; SecY; E; 1分子計測; 前駆体タンパク質; 蛍光プローブ

バクテリアにおいて、細胞質中で合成されたタンパク質の膜透過反応は、モータ因子SecA ATPaseと膜透過チャネルSecY/E複合体が中心的な役割を果たす。これらの因子は、互いに相互作用し機能していると考えらえるが、機能時のオリゴマー状態に関しては明確な結論が出ておらず論争が続いている。本研究では、SecA, SecYあるいは基質タンパク質proOmpAを蛍光標識し、それらをprobeとして用いた一分子計測を行う事により、この基本的かつ重要な問題に取り組んだ。計測感度を高める為、共同研究者の阪大・産研・野地研の協力を得て、全反射顕微鏡視野下において、平面膜中に蛍光標識膜透過装置を組み込んだ実験系を構築し、膜透過装置の一分子計測に初めて成功した。具体的には、1)材料とした用いたSecA, SecY, proOmpA分子全てを高純度に精製し、定量的に蛍光標識する実験条件を確定させた。2)各蛍光標識タンパク質が、野性型タンパク質と同様のタンパク質膜透過活性を保持していることを確認した。3)SecYEを組み込んだlipoosomeを平面膜へ融合させ、平面膜上の膜透過装置の動きとオリゴマー状態を初めて観察した。得られた結果から、平面膜上では、SecYEは単量体として存在していることが示唆された。SecAの添加により、SecYEの蛍光強度は増加する事が明らかとなったが、消光のパターンより、オリゴマー状態が変化したと考えるよりむしろ、SecA結合に伴いSecYEの構造変化が誘起された可能性が考えられた。「平面膜上のSecYEが実際に機能を保持しているか?」等、検討しなければならない事項はあるが、有用な測定系が確立できたと考えている。現在、更なる詳細な解析を進めている。

In the cytoplasm, the membrane permeability of the protein is reduced, and the membrane permeability of the enzyme SecA is reduced. The factors and interactions of these two kinds of arguments are discussed in detail. In this study, we have identified some basic important issues in molecular measurement. The measurement sensitivity is high. The cooperation of the co-researchers of Osaka University, Industrial Research Institute and Field Research Institute has been achieved. The total reflection film is in the field of micro-mirror. The light identification film transmission device in the flat film is assembled. The system is constructed. The film transmission device has been successfully used for molecular measurement. Specific materials are used to determine the conditions for high purity, quantitative and photometric identification of all OmpA molecules. 2)Each of the light markers is identified as having the same quality as the wild type, and the same membrane permeability as the wild type. 3)SecYE is composed of some flat film, some flat film, and some flat film. The result is that the film is flat, and the film is flat. The light intensity of SecA increases, the extinction decreases, and the structure of SecA increases. "SecYE on the flat film is actually functional." Such as, search, test, test. Now, more detailed analysis into the.

项目成果

Crystal structure of T. thermophilus Sec translocon with an Fab fragment implies a translocation-initiating state of SecY.

带有 Fab 片段的嗜热嗜热菌 Sec 易位子的晶体结构表明 SecY 处于易位起始状态。

• 发表时间: 2008
• 作者: Tsukazaki;T.;Mori;H.;et al. (計11名)
• 通讯作者: et al. (計11名)

Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.

• DOI: 10.1038/nature07421
• 发表时间: 2008-10-16
• 期刊: NATURE
• 影响因子: 64.8
• 作者: Tsukazaki, Tomoya;Mori, Hiroyuki;Fukai, Shuya;Ishitani, Ryuichiro;Mori, Takaharu;Dohmae, Naoshi;Perederina, Anna;Sugita, Yuji;Vassylyev, Dmitry G.;Ito, Koreaki;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

How does SecA ATPase interact with translocon and drive protein translocation?

SecA ATPase 如何与易位子相互作用并驱动蛋白质易位？

• 发表时间: 2008
• 作者: Mori;H.;Tsukazaki;T.;Nureki;O. and Ito;K.
• 通讯作者: K.