In vivo光架橋実験によるタンパク質膜透過装置の相互作用ネットワーク解析

利用体内光交联实验分析蛋白质膜渗透装置的相互作用网络

• 批准号: 19657061
• 负责人: 森 博幸
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657061/
• 关键词: in vivo光架橋; SecA; タンパク質膜透過; SecY; SecG; translocon; pBPA; アミノ酸アナログ; SecYEG; SecDF; Protein translocation

タンパク質膜透過装置SecYEGのサブユニットの1つであるSecGの全領域(2本の膜貫通領域と細胞質領域、ペリプラズム領域各1つ)を対象に、計37個のamber変異体をplasmid上に作製し、この部位にpBPAを導入したin vivo光架橋実験を行った。その結果、SecGの細胞質領域は、モータ因子SecA ATPase,チャネルの基幹因子SecYと近接していることが明らかとなった。これら因子との相互作用部位は、重複しているが、その作用様式は、SecAのヌクレオチド結合状態に依存して変化し、ATP結合型の条件では、SecAはSecGにより近接することを見いだした。加えて、SecGの第2の膜貫通領域内にpBPAを導入したある変異体においては、SecYとの間で架橋複合体を形成することを明らかにした。この結果は、本in vivo光架橋実験は、膜貫通領域内の相互作用解析においても有用であることを示している。更に、SecGの第2の膜貫通領域と細胞質領域の境界に位置する52番目、あるいはペリプラズム領域との境界に位置する72番目のアミノ酸をpBPAに改変したSecG変異体を用いた場合には、既存のSec因子に対する抗体とは反応せず、電気泳動上移動度の異なる新たな架橋複合体のバンドが検出された。C末端に付加したHis6タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーにより架橋複合体を精製し、質量分析により相手の同定を行った所、前者は、機能未知の細胞質膜タンパク質であることが明らかとなった。現在、同定された因子が真に架橋パートナーであるかどうかの検証を進めている。以上のように、部位特異的in vivo光架橋実験は、既存因子のみならず、未知因子との相互作用解析にも威力を発揮する画期的手法として、今後の応用が期待される。

SecYEG membrane transmission device SecYEG transmission device SecYEG membrane transmission device SecYEG membrane transmission device SecYEG transmission device SecYEG membrane transmission device SecYEG transmission device SecYEG membrane transmission device SecYEG transmission device SecYEG membrane transmission device SecYEG transmission device SecYEG As a result, SecG's cytoplasmic domain, SecA ATPase, SecY, and SecG's basic stem factor are closely related to each other. The interaction site of the factor is repeated, the interaction mode is changed, the binding state of the factor is changed, the condition of the ATP binding mode is changed, and the interaction mode of the factor is changed, the interaction mode of the factor is changed, and the interaction mode of the factor is changed. In addition, the second part of the membrane is introduced into the second part of the membrane. The results show that the interaction analysis in the field of membrane penetration is useful. In addition, SecG's second membrane penetration domain and cytoplasmic domain are located at 52 locations, 72 locations, and the presence of pBPA in SecG's second membrane penetration domain is associated with the presence of a new bridging complex. C-terminal addition of His6-terminal alignment, purification of bridging complexes, mass analysis of phase identity, former, function unknown, plasma membrane characterization Now, the same factor is true bridge. The above site-specific in vivo optical bridge is expected to be used in the future due to the presence of existing factors and the interaction analysis of unknown factors

项目成果

Conformational transition of Sec machinery inferred from bacterial SecYE structures.

• DOI: 10.1038/nature07421
• 发表时间: 2008-10-16
• 期刊: NATURE
• 影响因子: 64.8
• 作者: Tsukazaki, Tomoya;Mori, Hiroyuki;Fukai, Shuya;Ishitani, Ryuichiro;Mori, Takaharu;Dohmae, Naoshi;Perederina, Anna;Sugita, Yuji;Vassylyev, Dmitry G.;Ito, Koreaki;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

Crystal structure of T. thermophilus Sec translocon with an Fab fragment implies a translocation-initiating state of SecY.

带有 Fab 片段的嗜热嗜热菌 Sec 易位子的晶体结构表明 SecY 处于易位起始状态。

• 发表时间: 2008
• 作者: Tsukazaki;T.;Mori;H.;et al. (計11名)
• 通讯作者: et al. (計11名)

SecA ATPaseはどのようにtransloconと相互作用し、タンパク質膜透過を駆動しているのか?

SecA ATPase 如何与易位子相互作用并驱动蛋白质膜渗透？

• 发表时间: 2008
• 作者: 森 博幸、塚崎智也;濡木理、伊藤維昭
• 通讯作者: 濡木理、伊藤維昭