权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

酵母カルパインホモログCpl1の活性制御機構の解析

酵母钙蛋白酶同源物Cpl1活性调控机制分析

基本信息

批准号：
19044012
负责人：
前田達哉
金额：
$ 4.1万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に見出した、アルカリ刺激に応答してSnf7の局在が細胞質からエンドソームへと移行する現象を、蛍光免疫染色法を用いた顕微鏡観察で確認した。また、この移行が、Rim101経路上流のセンサー部構成因子の欠損変異株とエンドソーム・ソーティングを担うESCRT複合体構成因子の欠損変異株でも見られるかどうかを検討した。その結果、この移行はセンサー部には依存せず、ESCRT複合体機能に依存することが明らかになった。このことと一致して、アルカリ刺激によりエンドソーム・ソーティングが実際に一過的に阻害されることを、細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターの液胞への輸送を指標に確認した。これらの結果から、アルカリ刺激に応答したエンドソーム膜上における活性プロテアーゼ複合体の形成には、ESCRT複合体のターンオーバーの遅滞によるSnf7のエンドソーム膜上への貯留と、センサー部に依存したこれとは別の活性化ステップとが寄与していることが明らかになった。Rim101の切断で生じるC末端側断片のN末端は、何らかの修飾によりブロックされていてエドマン法による配列決定が困難であった。配列決定の困難を克服するため、Rim101のC末端に付加する精製用のタグを工夫し、さらに大量培養を採用することで、より精製度の高い切断産物を大量に調製する方法を確立した。しかしながら、十分量の標品を用いてもN末端配列を決定することはできず、修飾は切断後すみやかに起こる現象であることが示唆された。また、調製した切断産物をトリプシン消化して生じたペプチドを質量分析機によって解析したが、N末端に由来すると考えられる新規ペプチドは同定できなかった。

In the past year, the phenomenon of cytoplasmic migration was identified by light immunostaining and microscopic examination. Rim101, Rim 102, Rim 103, Rim 104, Rim 105, Rim 106, Rim 107, Rim 108, Rim 109, Rim 10 The results of this migration are dependent on the ESCRT complex function. The presence of such a substance in the cell membrane and the transport of fluid through the cell membrane are identified. The results of this study are as follows: (1) the formation of active protein complexes on the membrane,(2) the formation of ESCRT complexes on the membrane,(3) the storage of active protein complexes on the membrane,(4) the dependence of active protein on the membrane,(5) the formation of active protein complexes on the membrane,(6) the formation of active protein complexes on the membrane, and (7) the formation of active protein complexes on the membrane. Rim101 was cut off and the N-terminal fragment was modified. To overcome the difficulties of alignment determination, Rim101 C-terminal addition, purification, mass culture, and mass production methods were established. The N-terminal alignment of the standard product is determined by the use of the standard product. The product of the modulation is digested and analyzed by the mass analyzer.