膜結合型ATP依存性メタロプロテアーゼFtsHの一分子解析

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(1)タンデムおよび再構成細胞質を用いたFtsHの基質取り込み機構の解析構造から得られた情報から、FtsHは隣り合う2つのサブユニットが協同して基質である変性タンパク質をATP依存的にFtsHの内部に送り込んでいることが予想された。このことを生化学的に証明するためにFtsHの細胞質領域(sFtsH)の異なる2種類の変異体を再構成することにより証明する。基質結合部位とプロテアーゼ活性部位をつぶした変異体を混合することで、FtsHがリング内のサブユニット間で共同して基質を分解していることがわかった。また、ATP加水分解変異体と野生型でも同様に混合実験を行い、ATP加水分解変異体がリング内でドミナントネガティブに働くことがわかった。(2)昨年度、一分子蛍光偏光観察に用いる変異体を作成し、そのキャラクタリゼーションを行っていくつか候補となる変異体を作成した。本年度は、FtsHが顕微鏡観察系では極端に低濃度であるために不安定になったオリゴマーの安定化変異体の作成を試みた。(3)FtsHのX線結晶構造解析昨年度までにFtsHの様々なヌクレオチド結合状態の結晶をサンフルの変異体作成と結晶化の条件のスクリーニングという2つの角度から検討した。その結果、全長FtsHやFtsHの細胞質ドメインにおいて、様々な条件から結晶が得られた。本年度はこれらの結晶の条件をさらに詰めるとともに、新規な条件をスクリーニングした。