膜蛋白質のコンフォメーション特異的な結晶化を可能にする抗体断片の開発

开发能够实现膜蛋白构象特异性结晶的抗体片段

• 批准号: 20053004
• 负责人: 三村 久敏
• 金额: $ 2.82万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20053004/
• 关键词: 植物; 膜蛋白質; 膜輸送体; H^+ポンプ; 抗体断片; 結晶化; X線結晶解析

一般的に膜蛋白質の結晶化は極めて困難であると言われる。これを容易にする工夫の一つに抗体断片の利用がある。本研究では、膜蛋白質に広く応用可能な抗体断片を用いる結晶化方法として、膜蛋白質のコンフォメーションを特異的に認識する抗体断片を用いた結晶作製方法の確立を目指す。結晶化の対象としては、ピロリン酸を分解し、H^+の能動輸送を行う液胞型H^+-ピロホスファターゼ(V-PPase)を用いる。V-PPaseは分子量約8万のポリペプチドがホモ2量体を形成し、それぞれが16本の膜貫通ヘリックスを含む膜蛋白質である。アミノ酸配列からは、V-PPaseとこれまでに立体構造が明らかにされた蛋白質との間に構造の類似性はほとんど見いだされない。可溶性無機ピロホスファターゼで保存された基質結合モチーフとの類似性がわずかに見つかるのみである。植物の液胞膜に存在するV-PPaseは、液胞型ATPase(V-ATPase)と共に、液胞膜の二次能動輸送体にH^+駆動力を供給し、液胞を中心とした植物の物質輸送と蓄積を支える重要なH^+ポンプである。現在のところ、ヤエナリ胚軸より調製したV-PPaseにリコンビナント抗体断片のFvを結合させ、さらに脂質を加えることにより、V-PPase-Fv複合体の結晶を得ることに成功している。現在は結晶化方法をさらに改良・発展させることにより、X線結晶解析に供することが可能な良質の結晶作製が可能となっている。

Crystallization of general membrane proteins is extremely difficult. It is easy to make use of antibody fragments. This study aims to establish a crystallization method for membrane protein using antibody fragments and to identify specific membrane protein using antibody fragments. Crystallization, decomposition, and kinetic transport of H ^+ V-PPase has a molecular weight of about 80,000. It is composed of 16 native membrane proteins. The structure of the protein is similar to that of the protein. Soluble inorganic compounds are preserved in matrix and are similar in nature. The existence of V-PPase in the cell membrane of plants plays an important role in the supply of H^+ energy to the secondary active transporter of the cell membrane, the accumulation of H^+ energy in the cell center and the transport of substances in plants. Now, V-PPase is successfully synthesized by the Fv binding of V-PPase antibody fragment and the crystallization of V-PPase-Fv complex. Now the crystallization method is improved, developed and analyzed by X-ray crystallography. It is possible to produce good quality crystallization.