高速原子間力顕微鏡を用いたII型シャペロニンの1分子機能解析

使用高速原子力显微镜对 II 型伴侣蛋白进行单分子功能分析

• 批准号: 20059018
• 负责人: 横川 雅俊
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20059018/
• 关键词: フォールディング; シャペロニン; 1分子解析; 原子間力顕微鏡

II型シャペロニンのタンパク質フォールディング反応のサイクルを、高速原子間力顕微鏡(高速AFM)により直接とらえ解析することを目的に、以下の実験を行った。(1) 高速AFM装置の改良:高速AFMの測定セルに試料加熱用ヒーター、および、試料加熱用レーザー光源を取り付け、温度制御下における高速AFM観察手法を確立した。(2) II型シャペロニンのATP依存的構造変化の1分子解析:II型シャペロニンは、I型シャペロニン(GroEL/ES系)とは異なり共同因子(GroESに相当する分子)を持たず、自身の構造変化によりBuilt-in Lidが閉じ基質タンパク質のフォールディングを行うのが特徴である。ここではその反応の可視化を目的にII型のKS-1シャペロニンの二次元結晶体様試料に対し高速AFMによる1分子反応解析を行った。その結果、a) 温度制御下(40度)低濃度ATP存在下においてKS-1シャペロニンのBuilt-in Lidが閉じている(closed)状態・開いている(open)状態・その変化の過程を一分子リアルタイムスケールで可視化することに成功した。また、b) 観察された構造に関して、それぞれの構造寿命の1分子計測(on-time, off-time計測)を行ったところ、closed状態の構造寿命分布が1次指数関数的であることがわかった。この結果は、2次指数関数的分布を示すI型シャペロニンGroELとは異なる反応機構をKS-1シャペロニンが持つことを示唆する。c) KS-1シャペロニン以外のII型シャペロニンとしてHsp60の観察を試みたが、構造を安定に保つことが困難であり、高速AFMを用いた反応観察を行うことは出来なかった。

Type II シ ャ ペ ロ ニ ン の タ ン パ ク qualitative フ ォ ー ル デ ィ ン グ anti 応 の サ イ ク ル を, high-speed interatomic force 顕 micro mirror (AFM) high-speed に よ り directly と ら え parsing す る こ と に を purpose, the following の be 験 を line っ た. Modified: (1) high-speed AFM device の high-speed AFM の determination セ ル に sample heating ヒ ー タ ー, お よ び, sample heating レ ー ザ ー light を り pay け and temperature under the system of imperial に お け る high-speed AFM 観 examine methods を establish し た. (2) type II シ ャ ペ ロ ニ ン の ATP dependent structure variations of の molecular resolution: 1 type II シ ャ ペ ロ ニ ン は, type I シ ャ ペ ロ ニ ン (GroEL/ES) と は different な り common factors (GroES に quite す る) を hold た ず, own の structure - に よ り Built - in Lid が closed じ matrix タ ン パ ク qualitative の フ ォ ー ル デ ィ ン グ を line う の が, 徴 で あ る. こ こ で は そ の anti 応 の visualization を purpose に II の KS - 1 シ ャ ペ ロ ニ ン の secondary yuan form crystal others sample に し seaborne high-speed AFM に よ る 1 molecular anti 応 を line っ た. そ の results, a) temperature under the suppression (40 degrees c) in the presence of low concentration of ATP に お い て KS - 1 シ ャ ペ ロ ニ ン の Built - in Lid が closed じ て い る open (closed) state, い て い る (open) condition, そ の の - process を a molecular リ ア ル タ イ ム ス ケ ー ル で visualization す る こ と に successful し た. ま た and examines b) 観 さ れ た tectonic に masato し て, そ れ ぞ れ の の 1 molecular structure life measuring (on - time, off - time measuring) line を っ た と こ ろ, closed の structure life distribution が 1 times the number of index masato で あ る こ と が わ か っ た. こ の results は, twice the number of index masato distribution を す type I シ ャ ペ ロ ニ ン GroEL と は different な る を 応 authorities KS - 1 シ ャ ペ ロ ニ ン が hold つ こ と を in stopping す る. C) KS - 1 シ ャ ペ ロ ニ ン outside の II シ ャ ペ ロ ニ ン と し て Hsp60 の 観 examine を try み た が, tectonic を settle に bartender つ こ と が difficult で あ り, high-speed AFM を with い た anti 応 観 examine を line う こ と は out な か っ た.