導入外来遺伝子の発現機構の解析

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高等植物の遺伝情報に関する知見が不充分である為、細胞の増殖や分化など全能性に関与する遺伝子の同定やその発現の解析は容易ではない。一方、一定のDNA断片を染色体上の遺伝子に挿入してその遺伝子を不活性化させる挿入突然変異法は挿入DNA断片をプローブとしうるので、未知の遺伝子同定の為の一般的方法として微生物などでは広く用いられている。本研究は高等植物で選択可能なカナマイシン耐性(Km^r)遺伝子を用い、プロモーターを持たないKm^r遺伝子が植物染色体上の遺伝子に挿入された結果その遺伝子のプロモーターにより効率よく活性化されうる為の諸条件を検討し、挿入突然変異法開発の為の基礎データを集積することを目的とし、今回は以下の実験を行った。タバコ染色体上の遺伝子のエクソンにプロモーターのないKm^r遺伝子が挿入された場合を想定して、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、open reading frame(ORF)、Km^r遺伝子、CaMVのpolyadenylation siteを持ち植物中でdicistronic mRNAが生成しうるプラスミドを構築、直接法によりタバコプロトブラストに導入し、Km^r形質転換細胞の生成率を調べた。その結果、選択に用いたカナマイシンの濃度が50μg/mlの場合はORFが存在しない場合の20〜40%位の頻度でKm^r形質転換体の生成がみられた。この生成率はORFも35SプロモーターもないKm^r遺伝子を持つプラスミドを用いた場合の40倍以上にあたる。しかしながら200μg/ml以上の濃度で選択すると、ORFがない35Sプロモーターを持つKm^r遺伝子の場合はKm^r形質転換体の生成率はほとんど下らなかったが、ORFが有る場合にはKm^r形質転換体はほとんど得られなかった。この結果は、高等植物細胞へ導入した外来dicistronic geneが低頻度ではあるが活性化されうることを示唆しており、dicistronic geneとなるような挿入突然変異法の開発も可能性があるように思われる。