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血小板膜糖蛋白GPVの分子生物学的蛋白化学的解析

血小板膜糖蛋白GPV的分子生物学和蛋白质化学分析

基本信息

批准号：
63637505
负责人：
蔵本淳
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-63637505/
关键词：
活性化血小板血小板膜糖蛋白GPV purification 抗GPV抗体 ELISA 血栓症

项目摘要

トロンビンによる血小板活性化メカニズムにおいて、血小板膜糖蛋白GPVはGPIbとともに中心的役割を演じている。GPVを介するトランスメンプランコントロール機構解明を目的にGPVを分離、精製し、その物理化学的性状について検討するとともに、抗GPV抗体を作製し、血漿中に含まれるGPV及びそのフラグメントの定量を試みた。ヒト血小板を成分採血装置により集め、洗浄後、高塩濃度の緩衝液にてGPVを抽出した。硫安沈澱施行例、ファルマシア社FPLCシステムを用い、Superose12カラム、Mono Qカラムにて分離を進めた後、最終的にWGA-SepharoseによるアフィニティークロマトグラフィーによりGPVを精製した。精製GPVはSDS-PAGEにてPAS及びクマシーブルー陽性の単一バンドとして認められ、分子量は85KDと算定された。C_<18> reverse phaseカラムにより精製度を検討したが、単一のpeakを認め、全収量は2×10^<11>個血小板あたり約110μgであった。精製GPVはトロンビンにより水解され、分子量約65KDのフラグメント(GPVfl)と考えられるバンドに移行したが、Endoglycosidase F処理では変化を認めなかった。等電点電気泳動の結果、GPVはpl5.5〜6.5の間に複数のバンドを形成し、heterogenityが認められた。精製GPVを用いて家兎に免疫し、抗GPVポリクロナール抗体を作製した。抗体は一部ヒト免疫グロブリンとの交叉反応が認められたため、これを吸着除去した。精製抗体はGPV及びGPVflとのみ特異的に反応が認められた。抗GPV抗体を用い、EL1SA法にて血漿中のGPV及びGPVflの定量を試みたところ、正常者血漿中にもGPVの存在が確認され、一部の血栓症患者では病態に応じて増減を示し、血栓性疾患の予知、あるいは診断に有用であると考えられた。

Platelet membrane glycoprotein GPV is the central component of platelet activation. GPV isolation, purification, physicochemical properties, preparation of anti-GPV antibodies, and quantification of GPV in plasma Platelet component collection device, collection, washing, high concentration buffer, GPV extraction Sulphur precipitation example, FPLC system, Superose12 system, Mono Q system separation, final WGA-Sepharose system, GPV purification The purified GPV was purified by SDS-PAGE and its molecular weight was calculated to be 85KD. C_<18>reverse phase<11>Purified GPV has a molecular weight of about 65KD and a molecular weight of about 65KD. Isoelectric kinetic results, GPV pl5.5 ~ 6.5 between the formation of a plurality of points, heterogeneity is recognized. Refined GPV is produced by immunization and anti-GPV antibodies. A part of the antibody is removed by adsorption. Refined antibodies against GPV and GPVfl Anti-GPV antibodies were used to quantify GPV and GPVfl in plasma by EL1SA. The presence of GPV in plasma was confirmed in normal subjects. Some patients with thrombosis were pathologically impaired. The diagnosis of thrombotic diseases was useful.