αCaMKII mRNAのシナプス局在が脳の機能発現に果たす役割の解明

点击翻译按钮获取中文摘要

我々は樹状突起に局在するmRNAのうちCa2+/Calmodulin-dependent protein kinase II alpha-subunit(alpha-CaMKII)mRNAに注目し、樹状突起へ輸送されるためのシグナルとして3'非翻訳領域の30残基が必要不可欠であり、この配列が樹状突起への輸送を可能にするシス配列であることを証明した。次にこの輸送メカニズムを明らかにする目的で、シス領域に結合する蛋白因子の同定をおこなうことにした。既に^<32>Pで放射性ラベルしたシス領域を含む配列を用いて結合アッセイをおこなった結果、ラット脳ホモジネート中にこの配列と特異的に結合する約55kDa蛋白質が存在することを明らかにした。しかし、ラット大脳の細胞質分画であるS3フラクションをゲル濾過カラム、MonoQカラムで部分精製したところ、シス領域と結合活性を示したのは約42kDaと30kDaの2本のバンドであった。さらにポリウリジル酸固定化セファロースに吸着させたアフィニティーカラムを作製し、シス領域に結合する蛋白質の精製をおこなった。このカラム内でRNAプローブと部分精製したラット大脳の細胞質分画を反応させた後、1-2M KClの濃度勾配で溶出される蛋白質を回収し、各分画をSDS-PAGEで泳動した。すると1MのKCl溶出されてきた分画中に42kDaの分子量を示す蛋白質のバンドが検出された。この蛋白質をさらに2次元等電点電気泳動で分離し、独立した1つの蛋白質のスポットであることを確認し、このスポットをゲルから切り出し、蛋白質の部分配列の決定をおこなった。