αCaMKII mRNAのシナプスにおける翻訳調節機構の解明

突触αCaMKII mRNA翻译调控机制的阐明

• 批准号: 14035233
• 负责人: 森 泰丈
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14035233/
• 关键词: mRNA; 局所蛋白質合成; αCaMKII

我々はαCaMKII mRNAが自らを樹状突起に輸送するために必要とするシス領域を3'UTR上に同定し、この約30塩基から成る領域に結合する蛋白質を検索する目的で、RNAをプローブとするアフィニティーカラムの作製をおこなった。すでに放射性同位体でラベリングしたシス領域の配列をプローブとした結合アッセイを行ない、この領域に特異的に結合する蛋白質が約52kDaの分子量を持つことを明らかにしている。次のステップとしてシス配列の5'末端をビオチンで標識したオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、これをストレプトアビディンの担体に固着化したアフィニティーカラムを作製した。これをラット脳より抽出した細胞質画分を反応させた後、非特異的に吸着した蛋白質を洗浄し、RNA分解酵素でプローブに結合した蛋白質を溶出した。この分画を濃縮しSDS-PAGEにより分離したが、バックグラウンドが高く蛋白質として単離することは不可能であった。そこでシス領域を含む配列の3'末端にポリ(A)のリンカーを付加したプローブをRNAポリメラーゼで合成し、このプローブをポリ(U)リンカーを表面に有する担体に吸着させたアフィニティーカラムを作製した。これにラット脳の細胞質画分を反応させ、非特異結合を洗い出したのち、塩濃度を上昇させることにより溶出される蛋白質を回収した。これをSDS-PAGEにより分離し銀染色でゲルを染色したところ、放射性プローブで得られた結果と同様の分子量の蛋白質を単離することができた。現在この蛋白質を蛋白質分解酵素で処理し、アミノ酸配列の解析を行なっている。

Since I 々 は alpha CaMKII mRNA が ら を dendritic protrusions に conveying す る た め に necessary と す る シ を ス field 3 'UTR on に with し, こ の about 30 salt base か ら into に る field combining す る protein を 検 cable す る purpose で, RNA を プ ロ ー ブ と す る ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム の cropping を お こ な っ た. で す で に radioactive isotopic body ラ ベ リ ン グ し た シ の ス field match column を プ ロ ー ブ と し た combining ア ッ セ イ を line な い, こ の fields に specific に す る about 52 kda protein が の molecular weight を hold つ こ と を Ming ら か に し て い る. Time の ス テ ッ プ と し て シ ス match column の 5 'end を ビ オ チ ン で logo し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を chemical synthetic し に, こ れ を ス ト レ プ ト ア ビ デ ィ ン の supporter に fixation is changed し た ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を cropping し た. こ れ を ラ ッ ト 脳 よ り spare し た cytoplasm draw points を anti 応 さ せ た, nonspecific に after sorption し た を し at protein, RNA decomposition enzyme で プ ロ ー ブ に combining し た dissolubility protein を し た. こ の points draw を enrichment し sds-page に よ り separation し た が, バ ッ ク グ ラ ウ ン ド が く high protein と し て 単 from す る こ と は impossible で あ っ た. を そ こ で シ ス field containing む match column の 3 'end に ポ リ (A) の リ ン カ ー を plus し た プ ロ ー ブ を RNA ポ リ メ ラ ー ゼ で synthetic し, こ の プ ロ ー ブ を ポ リ (U) リ ン カ ー に を surface has す る supporter に sorption さ せ た ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を cropping し た. こ れ に ラ ッ ト 脳 の cytoplasm を draw points against 応 さ せ, nonspecific binding を い washing out し た の ち, salt concentration rising を さ せ る こ と に よ り dissolution さ れ る protein を back 収 し た. こ れ を sds-page に よ り separation し silver staining で ゲ ル を dyeing し た と こ ろ, radioactive プ ロ ー ブ で have ら れ と た results with others in の の protein molecular weight を 単 from す る こ と が で き た. Now, the <s:1> protein を protein-decomposing enzyme で is processed with <s:1> and ア なって ノ acids are arranged in a <s:1> analysis of the を line なって る る る.