磁場を用いた臍帯血由来間葉系幹細胞の長期凍結保存法の確立

脐带血间充质干细胞磁场长期冻存方法的建立

• 批准号: 15K20596
• 负责人: 小島 俊逸
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K20596/
• 关键词: 間葉系幹細胞; 長期凍結保存; 磁場

臍帯血由来間葉系幹細胞の分離培養・増殖が不十分で凍結保存をすることが困難であった。そこで、脂肪由来間葉系幹細胞にて研究を行った。細胞を増殖させた後、最終到達温度、植氷時間、磁場強度がMSCsの生存に及ぼす影響について検討を行った。細胞の凍結保存には、凍結保存液として10%ジメチルスルホキシド(DMSO)含有凍結保存液およびDMSO非含有凍結保存液を使用し、プログラムフリーザーにてそれぞれ一次冷却を施した後、-150℃の超低温フリーザーに保存した。細胞を7日間凍結保存した後、解凍し、生存細胞数の算定を行った。また、解凍後48時間培養した後の増殖細胞数についても同様に算定した。また、間葉系幹細胞の長期凍結保存を検討するために、ラット由来骨髄由来間葉系幹細胞を急速凍結と磁場を利用した凍結保存（最終到達温度-30℃、植氷時間15分間、磁場強度0.1mT：CAS群）を3年間凍結保存した後、解凍し、生存細胞の算定を行った。また、解凍後1週間、2週間培養した後の増殖細胞数についても同様に算定した。その結果、以下のことが明らかとなった。1．DMSO群、非含有DMSO群のいずれにおいても、最終到達温度-30℃、植氷時間15分間、磁場強度0.1mTの条件が、凍結したMSCsの最も高い生存率と増殖能を示した。DMSO群では細胞生存率が約85%、細胞増殖能が約101.43%といずれも高い値を示した。2．急速凍結群とCAS群では細胞生存率は49%、89%と大きくCAS群が高い生存率を示した。また細胞増殖能においても1週間後では、63%、131%、2週間後で164%は294%とともにCAS群が高い増殖能を示した。以上のことから磁場を用いたMSCの長期凍結保存がさまざまな治療における有用性が強く示唆された。

The isolation, culture and propagation of umbilical stem cells are difficult to preserve. The stem cells of mesenchymal stem cells derived from fat are studied in detail. The effects of cell growth time, final arrival temperature, implantation time and magnetic field intensity on MSCs survival and survival were discussed. The cells were frozen and stored at-150℃ after being cooled once in a freezing solution containing DMSO or a freezing solution containing DMSO. The number of viable cells was calculated after thawing and freezing during the day. The number of proliferating cells after 48 hours of culture was calculated. The long-term frozen preservation of mesenchymal stem cells was studied by rapid freezing and magnetic field (final temperature reached-30℃, implantation time 15 minutes, magnetic field strength 0.1mT: CAS group). The calculation of viable cells was carried out after thawing after 3 years of frozen preservation. The number of proliferating cells after culture for 1 week and 2 weeks after thawing was calculated in the same way. The result is that the following is the same as the result. 1. The highest survival rate of frozen MSCs was observed in DMSO group and non-DMSO group. The final temperature was-30℃. The implantation time was 15 minutes. The magnetic field intensity was 0.1 mT. The survival rate of DMSO group was about 85%, and the proliferation rate was about 101.43%. 2. The survival rate of cells in rapid freezing group and CAS group was 49% and 89% respectively. After 1 week, 63%, 131%, 164% and 294% of CAS group showed high reproductive activity. The above magnetic fields are useful for long-term frozen preservation of MSC, which is a strong indication of their therapeutic usefulness.

项目成果

Cranial suture-like gap and bone regeneration after transplantation of cryopreserved MSCs by use of a programmed freezer with magnetic field in rats.

• DOI: 10.1016/j.cryobiol.2015.04.001
• 发表时间: 2015-06
• 期刊: Cryobiology
• 影响因子: 2.7
• 作者: S. Kojima;M. Kaku;T. Kawata;M. Motokawa;H. Sumi;H. Shikata;T. H. Abonti;S. Kojima;T. Yamamoto;K. Tanne;K. Tanimoto