正常眼圧緑内障家系で同定された新規原因遺伝子機能解析およびモデルマウス作製

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我々は家族性正常眼圧緑内障の優性遺伝家系について、緑内障新規遺伝子Xを同定した。この遺伝子機能についての情報は乏しい。この新規遺伝子XがコードするタンパクXに対する抗体を用いて免疫染色を行った結果、タンパク質Xは網膜ミューラー細胞の細胞質に発現し、繊維状に網膜内を分布していることが明らかになった。緑内障は視神経損傷によって引き起こされることが知られているが、ミューラー細胞の生理機能の低下が視神経細胞の機能に影響する可能性が示唆された。研究期間中に使用してきた市販の抗体が製造中止となり、マウス網膜組織の染色ができなくなった。より詳細な発現解析が困難となったため、タンパク質Xに対する抗体を自前で作製し現在抗体の品質を検証中である。さらに、タンパク質Xのアミノ酸配列がヒトとマウスで高く保存されていることから、CRISPR/Cas9システムによるノックインマウスの作製を試みた。遺伝子変異の位置がCas9のパム切断サイトから離れていることから困難が予想されたが遺伝子X内の異常な遺伝子配列のマウスが複数作製され、今後有用と思われる遺伝子改変マウスが得られたが、目的とした遺伝子変異を持つマウスは得られなかった。継続して目的とするマウスを作製することに加えて、得られた遺伝子改変マウスに視機能低下が観察されるか、網膜の観察を行う。これらの実験と並行して遺伝子Xをクローニングし、発現ベクターを用いたHEK293T細胞での強制発現実験を行い、ウェスタンブロッティングを用いてタンパク質Xの野生型と変異型の発現を確認した。変異型タンパク質の強制発現実験では末端が切断されたタンパク質が優位に検出された。遺伝子変異によって、片アリルからは切断されたタンパク質Xの発現量が上昇し、ミューラー細胞の機能に影響していると考えられる。今後変異型のタンパク質Xついて、正常眼圧緑内障との関係をより詳細に解明していく。