核酸結合性蛋白質との結合をトリガーとした、蛋白質架橋反応性核酸誘導体の開発

通过与核酸结合蛋白的结合引发蛋白质交联反应性核酸衍生物的开发

• 批准号: 17K14509
• 负责人: 山田 研
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17K14509/
• 关键词: 核酸誘導体; 蛋白質架橋反応性分子; オリゴヌクレオチド

核酸結合性蛋白質はDNAやRNAに結合し、多くの細胞内遺伝子発現制御機構に関わっていおり、その中でも様々な疾患との関連性をもつmiRNAは、RNA-蛋白質複合体が作用本体として機能している。しかし、その複合体の詳細な立体構造など未解明な点も多く、新たな解析ツールの開発が望まれている。本申請課題では核酸２重鎖に近接した蛋白質に対して高い選択性で架橋形成する方法論の開発を目指した。具体的に、マイケル反応受容体となるビニル基を搭載した1,3,5-トリアジンを有する核酸誘導体が、２重鎖形成時に相補塩基との水素結合形成により反応点であるビニル基がメジャーグルーブ側に位置し、そこへ近接した核酸結合蛋白質の求核的アミノ酸と反応することを期待した。本年度はデザインした核酸誘導体を有するオリゴヌクレオチド合成法の確立、および標的モデルとして結晶構造が明らかになっている酵素蛋白質である、Hhal-DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1)を設定した。その理由として、DNAと複合体を形成時に、特定のシトシン塩基の6位近傍に求核性アミノ酸であるシステインが近接するため、このシトシンを本研究で開発した架橋反応性核酸塩基に置換することで、システインへの架橋反応が進行すると考えたためである。実際に反応特性を検討したところ、大変興味深いことに、DNMT1に対して高効率に架橋反応が進行したことをSDS-PAGEにて確認した。反応の特異性を検討するために種々反応条件を検討したところ、過剰量のメルカプトエタノール存在下でも問題なく反応が進行したこと、相補鎖存在下のみ高効率に架橋反応が進行することも確認できた。これら結果から、本研究で開発した核酸誘導体は標的となる求核性アミノ酸残基が近接した時のみ反応性を示すこと、また自鎖、相補鎖、蛋白質３者複合体を形成して架橋反応が効率的に進行したことが示唆された。

Nucleic acid-binding proteins bind to DNA and RNA, and many intracellular gene expression control mechanisms are involved in the interaction between miRNA and RNA-protein complexes. The detailed three-dimensional structure of the complex is expected to be developed in the future. The subject of the present application is the development of a methodology for the formation of highly selective bridges between nucleic acids and proteins. Specific nucleic acid receptors are loaded with 1,3,5-amino acids and are expected to bind to amino acids and amino acids in the formation of nucleic acid inducers and 2-fold locks. This year, we have established a new method for the synthesis of nucleic acid inducers, a new method for the synthesis of target DNA, a new method for the synthesis of enzyme proteins, and a new method for the synthesis of HAL-DNA inducers (DNMT1). In this study, we have developed a new method of bridging the nucleotide sequence in DNA complexes. In addition to the above, it is also possible to determine whether the reaction rate is high or low by SDS-PAGE. In the presence of a specific reaction, the reaction condition is discussed, and in the presence of a complementary reaction, the reaction condition is confirmed. The results of this study reveal that nucleic acid elicitors target the formation of a protein 3-part complex, which is characterized by the presence of a nuclear acid residue in proximity to a protein 3-part complex, self-locking, phase complementary locking, and bridging.