角層バリア形成の分子基盤の解析

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1. 表皮「上層」で特異的にSyntaxin-4をノックアウトしたSyntaxin-4コンディショナルノックアウトマウスを作製し、Syntaxin-4のCE形成における役割を解析する。そのために、前年度に表皮上層プロモーター (SASPase、Involucrin 、Keratin-1) 下でCreを発現するヘアレスマウスの作製に着手した。今年度は各Creマウスを、Cre/loxPによる組換えによりtdTomatoを発現するマウスと交配することでCreによる組換えが皮膚表皮のどの層から起こるのかを明らかにした。また、前年度に作成を開始したSyntaxin-4 floxマウスはキメラマウスのセレクション・CAG-Flpマウスと交配を終え、表皮上層特異的にCreを発現する各マウスとSyntaxin-4 floxマウスを交配中である。2. 生体マウス表皮に外来遺伝子をまだらに導入する方法の確立に成功した。そこでSyntaxin-4とEGFPの融合タンパク質を発現するプラスミドを生体マウス表皮に導入し、Syntaxin-4を強制発現した影響を顕微鏡下で観察した結果、Syntaxin-4が角化に影響を与える可能性が示唆された。3. CE形成過程におけるSyntaxin-4の影響を解析するためにCRISPR/Cas9システムを用いSASPaseプロモーター下流にSyntaxin-4とEGFPの配列を挿入したマウスを作成した。Syntaxin4とEGFPの融合タンパク質を発現するマウスが1匹生まれたが、そのマウスは正常ではなく全身が硬い膜のような組織に覆われていた。このマウスの皮膚切片を作成し観察した結果、Syntaxin-4とEGFPの融合タンパク質は表皮上層で発現しており、このマウスの角質層は正常なマウスに比べて厚かった。