レギュローム解析を基盤としたサルモネラC1pXPによる遺伝子発現制御機構の研究

基于调控组分析的沙门氏菌C1pXP基因表达调控机制研究

• 批准号: 26860282
• 负责人: 佐藤 慶治
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014 至 2015
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26860282/
• 关键词: タンパク質分解

サルモネラのAAA+プロテアーゼClpXPがファゴソーム内で分解している基質候補の探索を目的として、これまでに申請者は、基質の分解を途中で停止させ基質をトラップする系を構築し、トラップした基質サンプルを質量分析にかけ、256の基質候補を得ている。この中で、ファゴソーム条件下で機能すると考えられている転写因子・グローバルレギュレーターを5件(SsrB、PmrD、IscR、Re1A、AcnB)、細胞分裂に関わる3つの候補(ZapC、Bo1A、SeqA)を選び、Hisタグ融合タンパク質発現系を構築した。これらの候補について、野生株とclpX欠損株における細胞内蓄積を比較したところ、PmrDとZapCについて、clpX欠損株における細胞内蓄積が見られた。さらに、タンパク質合成阻害剤を用いて、細胞内でのタンパク質安定性の変化を検討した結果、clpX欠損株においてPmrD及びZapCは安定化することを明らかにした。以降、2つの候補のうち、PmrDに着目して研究を進めた。PmrDは、サルモネラ菌体内でClpXPによって分解制御されていると考えられたため、次にin vitro分解実験の系を構築して、PmrDがClpXPによって直接分解されるかどうかの検討を行った。まず、Hisタグ融合PmrDの精製条件の検討を行い、90%以上の純度での精製条件を確立した。また、ここで得られた精製PmrDを用いて抗PmrD抗体を作成した。現在報告されている幾つかの基質分解条件で分解実験を行ったが、ClpXPによるPmrD分解はin vitroでは起こらなかった。CLpXPの基質の中には、アダプター因子と呼ばれる第3の因子と結合することで、自身の分解速度が大幅に上昇するケースが多数報告されている。PmrDについても、細胞内での安定性実験の結果と、in vitroの系での結果が食い違う理由として、細胞内でPmrDに結合してPmrD分解速度と量を調節する第3の因子の存在が考えられた。また、PmrDはLPS modificationと胆汁酸への感受性に関係することが知られているが、clpX欠損株は胆汁酸に対して感受性となることも明らかにしている。

The AAA+ matrix of the production process is classified into ClpXP and 256 matrix candidates are selected for the purpose of exploring the matrix candidates in the decomposition process. Under these conditions, the function of cell division is studied, and the quality development system of cell division is constructed by selecting 5 candidates (SsrB, PmrD, IscR, Re1A, AcnB), 3 candidates (ZapC, Bo1A, SeqA), and 3 candidates (Bo1A, SeqA). The intracellular accumulation of these candidate strains, wild strains, and clpX deficient strains was compared with that of PmrD and ZapC deficient strains. The results of the study on the inhibition of protein synthesis and the stability of protein in cells, as well as the study on the stability of protein synthesis and protein synthesis in clpX deficient plants, are as follows: To drop, 2, PmrD PmrD is used to construct ClpXP decomposition system in vitro. The purification conditions of His fusion PmrD were studied and the purification conditions of purity of more than 90% were established. PmrD was purified by using anti-PmrD antibody. Now we report the decomposition conditions of the matrix, ClpXP, PmrD, in vitro. CLpXP's matrix has a large increase in the decomposition rate of the third factor. PmrD binding, intracellular stability, results, reasons, intracellular PmrD binding, PmrD decomposition rate, and the existence of a third factor. PmrD LPS modification bile acid sensitivity relationship, clpX deficiency bile acid sensitivity relationship, clpX deficiency bile acid sensitivity relationship