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Diels-Alder反応を触媒する酵素が持つ遷移状態制御の解明

阐明催化第尔斯-阿尔德反应的酶的过渡态控制

基本信息

批准号：
15KT0068
负责人：
渡辺賢二
金额：
$ 11.56万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-07-10 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

糸状菌Chaetomium globosumによって生産されるSch210972は、その分子内にオクタリン(octahydronaphthalene)骨格を有することから、生合成にDiels-Alder反応が関与すると推測されていた。我々はこれまでに、C. globosumにおける遺伝子破壊実験、Aspergillus nidulans異種宿主発現系による生合成系の再構築により、Diels-Alder反応を触媒する酵素遺伝子としてcghAを同定した。cghA存在下における生合成産物は単一の立体異性体であるのに対し、非存在下では非天然型のジアステレオマーが生産されたことから、CghAは立体選択的なDiels-Alder反応を触媒する酵素と予想された。そこで、本研究においてはCghAの触媒機構を実験的に解明することを目指した。タンパク質のX線結晶構造解析により、CghAの触媒する反応の機構を解析できると考えた。はじめに、C. globosumより調製したcDNAをもとに5’-および3’-RACE法によりcghAの全遺伝子配列を決定した。種々検討の結果、コドンを最適化させたcghA合成遺伝子の利用により、大腸菌を宿主とした目的タンパク質の大量生産に成功した。続いて、クロマトグラフィーによる精製、結晶化条件のスクリーニングを経て、CghAタンパク質結晶の獲得に成功した。さらに計算化学を用い、基質、生成物および得られたタンパク質構造を用いたドッキングシミュレーションを行い、活性部位を予測した。予測された活性部位近傍のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素の変換活性を観測することで、位世界で初めて酵素Diels-Alderaseがどのようにして立体選択的な環化反応を触媒するのかを示すことに成功した。

Chaetomium globosum spp., E. coli, E. coli Sch210972, octahydronaphthalene, bone lattice, biosynthesis, anti-Diels-Alder, and anti-DNA synthesis. We have confirmed that the products of globosum, C. Aspergillus nidulans, Aspergillus nidulans, and Diels-Alder are the same as those of the host system, the host system, the synthetic system, and the enzyme enzyme of the enzyme. In the presence of cghA, there are three-dimensional synthetic substances, one-dimensional body, one-dimensional body, one The purpose of this study is to explain the meaning of the target of the CghA catalyst. The results of X-ray analysis and CghA catalyst analysis were used to analyze the performance of the system. The whole sub-column of the 3'-RACE method, the cghA column, the decision column, the globosum column, the cghA column, the column. The results of various tests, the most efficient cghA synthesis method, the use of bacteria and host bacteria to produce large quantities of bacteria successfully. The results showed that the crystallization conditions, and the crystallization conditions were tested. In this paper, we calculate that the chemical products can be used in the calculation of chemistry, and the active parts can be used in the calculation of chemistry. The environmental reaction catalyst for the stereospecific selection of the active site of Diels-Alderase in the world, which was successfully selected, was successfully introduced into the active part of the plant.