Diels-Alder反応を触媒する酵素が持つ遷移状態制御の解明

阐明催化第尔斯-阿尔德反应的酶的过渡态控制

基本信息

批准号：
15KT0068
负责人：
渡辺賢二
金额：
$ 11.56万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-07-10 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

糸状菌Chaetomium globosumによって生産されるSch210972は、その分子内にオクタリン(octahydronaphthalene)骨格を有することから、生合成にDiels-Alder反応が関与すると推測されていた。我々はこれまでに、C. globosumにおける遺伝子破壊実験、Aspergillus nidulans異種宿主発現系による生合成系の再構築により、Diels-Alder反応を触媒する酵素遺伝子としてcghAを同定した。cghA存在下における生合成産物は単一の立体異性体であるのに対し、非存在下では非天然型のジアステレオマーが生産されたことから、CghAは立体選択的なDiels-Alder反応を触媒する酵素と予想された。そこで、本研究においてはCghAの触媒機構を実験的に解明することを目指した。タンパク質のX線結晶構造解析により、CghAの触媒する反応の機構を解析できると考えた。はじめに、C. globosumより調製したcDNAをもとに5’-および3’-RACE法によりcghAの全遺伝子配列を決定した。種々検討の結果、コドンを最適化させたcghA合成遺伝子の利用により、大腸菌を宿主とした目的タンパク質の大量生産に成功した。続いて、クロマトグラフィーによる精製、結晶化条件のスクリーニングを経て、CghAタンパク質結晶の獲得に成功した。さらに計算化学を用い、基質、生成物および得られたタンパク質構造を用いたドッキングシミュレーションを行い、活性部位を予測した。予測された活性部位近傍のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素の変換活性を観測することで、位世界で初めて酵素Diels-Alderaseがどのようにして立体選択的な環化反応を触媒するのかを示すことに成功した。

Sch210972是由丝状真菌碎片球产生的，其分子内有一个八脑磷灰石主链，并且有人推测，生物合成将涉及Diels-Alder反应。我们先前已将CGHA鉴定为Globosum中基因破坏实验催化Diels-Alder反应的酶基因，从而用Aspergillus nidulans nidulans异源宿主表达系统重建了生物合成系统。在CGHA存在下的生物合成产物是单一立体异构体，而在没有CGHA的情况下，产生了不自然的非对映异构体，表明CGHA是一种酶，可催化立体选择性的Diels-Alderder-Alderderderderder-alderderderder反应。因此，在这项研究中，我们旨在实验阐明CGHA的催化机制。我们认为蛋白质的X射线晶体结构分析可用于分析CGHA催化的反应的机理。首先，CGHA的整个基因序列是通过基于球蛋白梭菌制备的5'-和3-RACE方法确定的。经过各种研究，我们通过使用密码子优化的CGHA合成基因成功地批量生产了大肠杆菌作为宿主的靶蛋白。随后，进行了色谱和筛选结晶条件的纯化，并成功获得了CGHA蛋白晶体。此外，计算化学用于使用底物，产品和所得蛋白质结构进行对接模拟，以预测活性位点。通过观察突变酶的转化活性，将突变引入预测活性位点附近的氨基酸残基，我们成功地证明了世界上第一次在酶 - 多尔斯 - 积aldersy如何催化立体选择性环化反应。