新規アッセイ系による小胞体膜上糖鎖のフリップフロップ現象の分子機構解明

真核生物アスパラギン結合型糖鎖の生合成過程において、小胞体膜に挿入されたドリコールピロリン酸結合型糖鎖（Dolihol pyrophosphate Linked Oligosaccharide; DLO）は細胞質側から内腔側へフリップフロップすることが知られている。本研究はフリップフロップの分子機構を解明すべく、膜上のDLOの挙動を追跡する小胞体膜反応場の構築を目指した。その構築手法として、リポソームのリン脂質を、酵素反応によりDLOに変換することを計画した。具体的には、（1）標識化したUDP-GlcNAc誘導体を供与体として、N-acetylglucosamine-phosphotransferase（DPAGT1）の作用でGlcNAcモノリン酸をリン脂質に対して導入し、（2）導入されたGlcNAc残基を受容体とし、endo-β-N-acetylglucosaminidase（ENGase）を用いてオキサゾリン化糖鎖を導入することとした。今年度はこれら2種類の反応系に必要な基質プローブの化学合成を行い、非リポソーム環境にて酵素反応を実施した。(１)の実験では、ドリコールモノリン酸類縁体であるシトロネロールリン酸に対し、クリックケミストリーによる標識が可能なアルキニル基を導入したUDP-N-アセチルグルコサミンプローブ（UDP-GlcNAlk）を基質として組換えDPAGT1を作用させた。その結果、DPAGT1がこの基質に対して活性を示し、非天然型構造を許容することを明らかにした。

真核生物アスパラギン結合型糖鎖の生合成過程において、小胞体膜に挿入されたドリコールピロリン酸結合型糖鎖（Dolihol pyrophosphate Linked Oligosaccharide; DLO）は細胞質側から内腔側へフリップフロップすることが知られている。本研究はフリップフロップの分子機構を解明すべく、膜上のDLOの挙動を追跡する小胞体膜反応場の構築を目指した。その構築手法として、リポソームのリン脂質を、酵素反応によりDLOに変換することを計画した。具体的には、（1）標識化したUDP-GlcNAc誘導体を供与体として、N-acetylglucosamine-phosphotransferase（DPAGT1）の作用でGlcNAcモノリン酸をリン脂質に対して導入し、（2）導入されたGlcNAc残基を受容体とし、endo-β-N-acetylglucosaminidase（ENGase）を用いてオキサゾリン化糖鎖を導入することとした。今年度はこれら2種類の反応系に必要な基質プローブの化学合成を行い、非リポソーム環境にて酵素反応を実施した。(１)の実験では、ドリコールモノリン酸類縁体であるシトロネロールリン酸に対し、クリックケミストリーによる標識が可能なアルキニル基を導入したUDP-N-アセチルグルコサミンプローブ（UDP-GlcNAlk）を基質として組換えDPAGT1を作用させた。その結果、DPAGT1がこの基質に対して活性を示し、非天然型構造を許容することを明らかにした。