初代培養肝細胞におけるアポトーシス制御機構の解明

原代培养肝细胞凋亡控制机制的阐明

• 批准号: 08760307
• 负责人: 高木 篤也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: 国立衛生試験所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760307/
• 关键词: アポトーシス; P53; Bcl-x; Bcl-2; 肝細胞; ペルオキシソーム増殖剤; ciprofibrate; TGF-Beta

ペルオキシソーム増殖剤がTransforming growth factor-beta(TGF-beta)により誘導される肝細胞のアポトーシスを抑制することが報告されており、これらの作用機構を明らかにするため以下の実験を行った。雄F-344ラット(体重約300g)より、コラゲナーゼ灌流法にて、初代培養ラット肝細胞を採取した。培養液にはWilliams Medium E(10%牛胎児血清を含む)を用い、5%の濃度のCO_2インキュベータ-で培養を行った。プレートに細胞をまいて2時間後、付着肝細胞に、ペルオキシソーム増殖剤のciprofibrateを200μMの濃度で投与した。投与1時間後に、TGF-betaを1または3ng/mlの濃度で投与した。最終投与18および42時間後に細胞を採取し、2X gel loading bufferを加え、99度10分加熱、蛋白試料とし-80度で保存した。また、各時点で細胞を蛍光染色し、核のfragmentationをカウント、アポトーシスの指標とした。SDS電気泳動は12.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、蛋白定量後各レーンあたり10μgを用いた。泳動終了後、セミドライブロッターでニトロセルロース膜に転写し、ECL法でアポトーシス関連蛋白を定量した。その結果、アポトーシス細胞数は18時間後のTGF-betaの3ng群で47%と対照群の8%に比べ有意に増加した。ciprofibrateを前投与すると29%となり、その増加は有意に抑制された。42時間後でも同様に抑制が認められた。P53蛋白レベルおよびBcl-2蛋白レベルは各群とも対照群に比較して明かな差は認められなかった。しかし、Bcl-xレベルはTGF-beta投与により、18時間で対照群より減少し、42時間後ではほとんど検出できないレベルまで減少した。一方、ciprofibrateはこのBcl-x蛋白発現に対して影響を及ぼさなかった。以上の結果、TGF-betaによる肝細胞アポトーシスにBcl-xのダウンレギュレーションが関与していることが示唆されたが、ciprofibrateのアポトーシス抑制機構はP53、Bcl-2およびBcl-x蛋白量の変動を介していないことが明らかとなった。

据报道，过氧化物酶体增殖物抑制了通过转化生长因子β（TGF-β）引起的肝细胞凋亡，并进行了以下实验以阐明这些作用的机理。通过胶原酶灌注方法从雄性F-344大鼠（重量约300克）收集原发性大鼠肝细胞。该培养基与Williams培养基E（含有10％胎牛血清）一起使用，并以5％的浓度在CO_2孵化器中培养。将细胞倒入板中两个小时后，将附着的肝细胞与过氧化物酶体增殖物电抗元素以200μM的浓度施用。给药后一小时，以1或3 ng/ml的浓度施用TGF-β。最终给药后18和42小时收获细胞，加入2倍凝胶载荷缓冲液，加热99°C 10分钟，并将其作为蛋白质样品存储在-80°C下。还将细胞在每个时间点进行荧光染色，并计数细胞核的碎裂并用作凋亡的指标。对于SDS电泳，使用12.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质定量后使用10μg。径流后，使用半滴Brotter将细胞转移到硝酸纤维素膜中，并通过ECL方法对与凋亡相关的蛋白质进行定量。结果，在18小时后3NG组的TGF-β组中，凋亡细胞的数量显着增加，而对照组为47％，为8％。电抗元素的预热导致29％，并且增加的增加显着降低了。即使在42小时后也观察到类似的抑制。与对照组相比，每组p53蛋白水平和Bcl-2蛋白水平之间没有明显的差异。但是，与对照组相比，在42小时后，BCL-X水平在18小时时降低到几乎无法检测到的水平。另一方面，电纤维酸盐对这种Bcl-X蛋白表达没有影响。上述结果表明，BCl-X的下调参与由TGF-β引起的肝细胞凋亡，但揭示了抑制抑制环纤凋亡中凋亡的机制不会介导p53，BCl-2和Bcl-2和Bcl-X蛋白的量的变化。