初代培養肝細胞におけるアポトーシス制御機構の解明

原代培养肝细胞凋亡控制机制的阐明

• 批准号: 08760307
• 负责人: 高木 篤也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: 国立衛生試験所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760307/
• 关键词: アポトーシス; P53; Bcl-x; Bcl-2; 肝細胞; ペルオキシソーム増殖剤; ciprofibrate; TGF-Beta

ペルオキシソーム増殖剤がTransforming growth factor-beta(TGF-beta)により誘導される肝細胞のアポトーシスを抑制することが報告されており、これらの作用機構を明らかにするため以下の実験を行った。雄F-344ラット(体重約300g)より、コラゲナーゼ灌流法にて、初代培養ラット肝細胞を採取した。培養液にはWilliams Medium E(10%牛胎児血清を含む)を用い、5%の濃度のCO_2インキュベータ-で培養を行った。プレートに細胞をまいて2時間後、付着肝細胞に、ペルオキシソーム増殖剤のciprofibrateを200μMの濃度で投与した。投与1時間後に、TGF-betaを1または3ng/mlの濃度で投与した。最終投与18および42時間後に細胞を採取し、2X gel loading bufferを加え、99度10分加熱、蛋白試料とし-80度で保存した。また、各時点で細胞を蛍光染色し、核のfragmentationをカウント、アポトーシスの指標とした。SDS電気泳動は12.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、蛋白定量後各レーンあたり10μgを用いた。泳動終了後、セミドライブロッターでニトロセルロース膜に転写し、ECL法でアポトーシス関連蛋白を定量した。その結果、アポトーシス細胞数は18時間後のTGF-betaの3ng群で47%と対照群の8%に比べ有意に増加した。ciprofibrateを前投与すると29%となり、その増加は有意に抑制された。42時間後でも同様に抑制が認められた。P53蛋白レベルおよびBcl-2蛋白レベルは各群とも対照群に比較して明かな差は認められなかった。しかし、Bcl-xレベルはTGF-beta投与により、18時間で対照群より減少し、42時間後ではほとんど検出できないレベルまで減少した。一方、ciprofibrateはこのBcl-x蛋白発現に対して影響を及ぼさなかった。以上の結果、TGF-betaによる肝細胞アポトーシスにBcl-xのダウンレギュレーションが関与していることが示唆されたが、ciprofibrateのアポトーシス抑制機構はP53、Bcl-2およびBcl-x蛋白量の変動を介していないことが明らかとなった。

Transforming growth factor-beta(TGF-beta) is the most important factor in inducing hepatocyte apoptosis. Male F-344 (weight about 300g) was collected by perfusion method and primary culture of hepatocytes. Williams Medium E(containing 10% fetal bovine serum) was used in the culture medium at a concentration of 5% CO_2. After 2 hours of incubation, the cells were treated with ciprofibrate at a concentration of 200μM. 1 ng/ml after administration. After 18 minutes of final dosing, the cells were taken, 2X gel loading buffer was added, the protein samples were heated at 99 ° C for 10 minutes, and stored at-80 ° C. At each time point, the cells were stained with light, and the nuclear fragmentation was measured. SDS Electrophoresis: 12.5% for protein quantification, 10μg for protein quantification After the end of the run, the protein was quantified by ECL. The number of TGF-beta cells increased significantly after 18 hours compared with 8% of the control group. Ciprofibrate is a 29% increase in previous investment and intentional suppression. After 42 hours, the same thing happened. P53 protein is the most important protein in the protein family. Bcl-x decreases after 18 hours and decreases after 42 hours. A side, ciprofibrate and Bcl-x protein expression in the impact of the The above results indicate that TGF-beta inhibits the expression of Bcl-x protein in hepatocytes, and that ciprofibrate inhibits the expression of P53, Bcl-2 and Bcl-x protein.