細胞増殖抑制因子の精製

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細胞の生理活性を調節する因子を検索し、豚脊髄の塩粗抽出液から細胞増殖の抑制効果を示す分画をみつけた。この画分をMDCK細胞(Maden Darby canine kidney cell line)の培養液に加えると細胞が偽足をちぢめて丸い形態となり、増殖をしなくなった。また、この画分を培養液に加えたMDCK細胞はトリパンブルーの色素排除活性を保っていた。そこで、増殖抑制活性の測定には、イ-グルMEM培地に2X10^4cells/mlで懸濁したMDCK細胞を96穴プレートに0.15mlまき、これにPBS(-)にとかした画分を0.15ml添加して一晩培養した後の細胞の形態変化を観察した。さらに、培養液を5%alamar Blueを含むものにかえ、alamar Blueの酸化・還元状態変化(細胞の還元活性を反映する)による吸光度変化から、細胞増殖活性を定量的に測定した。豚脊髄の塩粗抽出凍結乾燥物は、〜1mg/ml濃度で細胞増殖活性を半分に抑制した。この塩粗抽出凍結乾燥物をセファデクスG-25によるゲルろ過クロマトグラフィーにかけると、280nmの紫外吸収で4つのピークに分かれ、増殖抑制活性は2番目のピークにあった。これは分子量約1キロダルトンの溶出位置であった。この活性画分をQ-セファロースによるイオン交換クルマトグラフィーにかけると280nmの紫外吸収成分はほとんど吸着したが、この吸着成分には増殖抑制活性はなく、素通りした画分(280nmの吸収の1割以下)に活性があった。この素通折り画分は〜0.03mg/ml濃度で細胞増殖活性を半分に抑制した。したがって、この段階でこの増殖抑制因子は約300倍精製された。