MDCK細胞における極性輸送小胞と形質膜との融合装置の探索

点击翻译按钮获取中文摘要

イヌ腎臓上皮細胞であるMDCK細胞のapical形質膜とトランスゴルジネットワーク(TGN)由来の分泌小胞との膜融合に関わるタンパク質を探索するため、次の方法でタンパク質をスクリーニングした。Apical輸送小胞とbasolateral輸送小胞とを、Simonsらの方法でMDCK細胞より単離した。これらのタンパク質組成を二次元電気泳動法により調べ、両者に共通に存在するタンパク質をピックアップした。これらは、両小胞の共通機能である膜融合・膜小胞化などに関係している可能性が大きい。特に、その中でも膜タンパク質は、膜融合・膜小胞化機能に関する細胞装置の基幹となるタンパク質である可能性が大きい。二次元電気泳動ゲルより、膜タンパク質の一つ(VIP17)に注目し、microsequencing・oligo合成・PCR法によってMDCKのcDNAライブラリーよりVIP17のcDNAをクローニングした。VIP17は、膜四回貫通部位を持つ膜タンパク質(proteolipid)であった。ホモロジー検索の結果、ヒトTリンパ球の形質膜タンパク質であるMALや、ラットシュワン細胞のミエリン膜に局在するM14のホモログであった。また、HA-tagを付けたVIP17をMSCK細胞に発現させ、その細胞の内局在を間接螢光抗体法により調べた結果、VIP17-HAtagは、apocal、basolateral形質膜とapica輸送小胞に局在していることが分かった。現在、正確な細胞内局在とその細胞内機能(特に膜融合機能)を研究する目的で、VIP17の融合タンパク質・合成ペプチド・精製タンパク質を抗原とした抗VIP17モノクローナル抗体を作成中である。また同時に、蛍光性セラミドによるTGN由来小胞の蛍光ラベル化を試み、部分的に形質膜をpermeableにしたMDCK細胞を利用した形質膜-輸送小胞の膜融合アッセイ系を作っている。