I cell病の病態解明−発現ベクターを用いた病因遺伝子のクローニング−

阐明 I 细胞疾病的病理学 - 使用表达载体克隆致病基因 -

• 批准号: 09670807
• 负责人: 西垣 敏紀
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09670807/
• 关键词: I cell病; リソソーム; GlcNAc-1-P トランスフェラーゼ; クローニング

I cell病患者由来の培養皮膚線維芽細胞にピレン化合物を基質として加え、紫外線で選択する方法を用いてI cell病の原因遺伝子であるGlcNAc-1-P TF cDNAを発現クローニングすることを目的とした。1、選択条件の決定-紫外線照射の条件の決定正常およびI cell病患者の皮膚線維芽細胞に、Nピレン-ドデカノイルスフィンゴミエリン(P10-Spm)をアポリポプロテインE(1-1.5μg/nmol P10-Spm)と混合してリポソーム化し、培養細胞に取り込ませた。(1)12時間後に回収、脂質抽出後、TLCにてピレンセラミド、ピレンスフィンゴミエリンに分離、P10-Spmの分解率を検討した。(2)366nmの紫外線を照射し、I cell病患者の皮膚線維芽細胞のみが死滅する条件を決定した。2、ヒト肝pcD2cDNAライブラリー導入後の紫外線による選択ヒト肝pcD2cDNAライブラリー3μgをLipofectAMINE(GibcoBRL)15μgを用いて、I cell病患者皮膚線維芽細胞に導入した。48時間後に、上記方法にてリポソーム化したP10-Spm 20nmolを培養液中に加えた。24時間後に紫外線照射した後、培養を継続、生存コロニーを選択した。結果1、正常細胞では約80%のP10-Spmが分解、'I cell病患者細胞では分解は約7%であった。2、366nmの紫外線照射は、2本の15Wのランプ(長波長UV : 320-380nm(peak366nm))を用い、7mW/cm^2、15分間の照射にて、I cell病患者細胞はほぼ100%死滅、正常細胞の約60%が生存した。3、ヒト肝pcD2cDNAライブラリー導入後、紫外線選択にて選択されたクローンの培養液中のリソソーム酵素活性を測定することで目的の遺伝子の導入を確認中である。

I cell origin の cultivate skin line d bud cells に ピ レ ン compound を matrix と し て え, uv で sentaku す を る method with い て I cell disease cause of の survived 伝 で あ る GlcNAc - 1 - P TF cDNA を 発 now ク ロ ー ニ ン グ す る こ と を purpose と し た. 1, sentaku の の decision - ultraviolet radiation condition の decided to normal お よ び I cell の skin line d に bud cells, N ピ レ ン - ド デ カ ノ イ ル ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン (P10 - Spm) を ア ポ リ ポ プ ロ テ イ ン E (1-1.5 mu g/nmol P10-Spm (と) mixed with と てリポソ ム ム to と, cultured cells に to てリポソ 込ませた. (1) after 12 time に 収, lipid after extraction, TLC に て ピ レ ン セ ラ ミ ド, ピ レ ン ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン に separation, P10 - Spm の decomposition rate を beg し 検 た. (2)366nm <s:1> ultraviolet light を irradiation of <s:1> and the する conditions for the extinction of <s:1> linear spore-producing cells in the <s:1> skin of patients with i-cell disease are determined by を. 2, ヒ ト liver pcD2cDNA ラ イ ブ ラ リ ー after import の ultraviolet に よ る sentaku ヒ ト liver pcD2cDNA ラ イ ブ ラ リ ー 3 mu g を LipofectAMINE (GibcoBRL) 15 mu g を い て, I cell patients skin line d bud cells に import し た. After 48 hours, に and the above method にてリポソ ム ム ム dissolve たP10-Spm in 20nmolを culture medium に add えた. After 24 hours, に ultraviolet radiation た, culture を継続, survival コロニ を を select 択 択 た. Result 1: Normal cells で で approximately 80% <s:1> P10-Spmが decomposition, cells of patients with 'I cell 'で decomposition <e:1> approximately 7%であった. 2. 366nm <s:1> ultraviolet light irradiation <s:1>, 2 <s:1> 15W <s:1> ラ プ プ プ(long-wavelength UV: 320-380nm(peak366nm))を <s:1>, 7mW/cm ², 15 minutes of <s:1> irradiation にて, 100% of the cells of patients with I cell disease <s:1> ほぼ ほぼ died, and about 60% of normal cells <s:1> が survived た. 3, ヒ ト liver pcD2cDNA ラ イ ブ ラ リ ー after import, ultraviolet sentaku に て sentaku さ れ た ク ロ ー ン の medium, の リ ソ ソ ー ム determination of enzyme activity を す る こ と で purpose の heritage 伝 child の import を confirm で あ る.