HOX遺伝子群による骨格構造形成の制御機構の解析

Hox Cクラスターに属する遺伝子間での機能的協調の存在がこれまでの我々の研究から示唆されておりこれをさらに詳細に解析するためにHox Cクラスター全体を欠損したマウスの作製を行った。Hox Cクラスターを欠損させるためCre-loxPシステムを利用した。すなわちHox Cクラスターの両端にloxP配列を相同組み換えにより導入し、得られた細胞にCreリコンビナーゼを作用させることにより、loxP配列に挟まれたHox Cクラスターの遺伝子全体を欠損させることを試みた。Hox Cクラスターの両端にあるHoxc-4遺伝子とHoxc-13遺伝子の位置にloxP配列を挿入するために、2種類のベクターを構築した。CreリコンビナーゼによるloxP配列間での組み換えの効率はloxP配列間の距離が大きくなるほど低下すると考えられている。約100kbの距離での組み換え効率がどの程度であるのかは予測することが困難であったが、相当に低いものになると予想された。このためloxP配列間での組み換えが起こったときにのみピューロマイシン耐性になるような工夫を施した。これらのベクターを相同組み換え法を用いてES細胞に導入し二重変異細胞を得た。この細胞にCreリコンビナーゼの発現ベクターを導入し一過的に発現させ、ピューロマイシンによる選択を行いloxP間で組み換えを起こした細胞を得た。詳しい解析の結果この細胞では確かにHox Cクラスターが欠損していることが確認された。この細胞を用いキメラマウスを作製し、キメラマウスよりHox Cクラスターヘテロ変異マウスを得た。ヘテロ変異マウスは外見上正常であり、これらを交配しホモ変異マウスの作製を行っている。以上述べたように、Hox Cクラスター欠損マウスの作製及び染色体上の長大な領域を操作する技術の確立について目標を達成した。

Hox Cクラスターに属する遺伝子間での機能的協調の存在がこれまでの我々の研究から示唆されておりこれをさらに詳細に解析するためにHox Cクラスター全体を欠損したマウスの作製を行った。Hox Cクラスターを欠損させるためCre-loxPシステムを利用した。すなわちHox Cクラスターの両端にloxP配列を相同組み換えにより導入し、得られた細胞にCreリコンビナーゼを作用させることにより、loxP配列に挟まれたHox Cクラスターの遺伝子全体を欠損させることを試みた。Hox Cクラスターの両端にあるHoxc-4遺伝子とHoxc-13遺伝子の位置にloxP配列を挿入するために、2種類のベクターを構築した。CreリコンビナーゼによるloxP配列間での組み換えの効率はloxP配列間の距離が大きくなるほど低下すると考えられている。約100kbの距離での組み換え効率がどの程度であるのかは予測することが困難であったが、相当に低いものになると予想された。このためloxP配列間での組み換えが起こったときにのみピューロマイシン耐性になるような工夫を施した。これらのベクターを相同組み換え法を用いてES細胞に導入し二重変異細胞を得た。この細胞にCreリコンビナーゼの発現ベクターを導入し一過的に発現させ、ピューロマイシンによる選択を行いloxP間で組み換えを起こした細胞を得た。詳しい解析の結果この細胞では確かにHox Cクラスターが欠損していることが確認された。この細胞を用いキメラマウスを作製し、キメラマウスよりHox Cクラスターヘテロ変異マウスを得た。ヘテロ変異マウスは外見上正常であり、これらを交配しホモ変異マウスの作製を行っている。以上述べたように、Hox Cクラスター欠損マウスの作製及び染色体上の長大な領域を操作する技術の確立について目標を達成した。