新しい長寿命核RNAの機能解析とRNA依存性RNA合成酵素の抽出

新的长寿命核RNA的功能分析和RNA依赖性RNA合成酶的提取

• 批准号: 09877036
• 负责人: 福田 優
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: 福井医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877036/
• 关键词: RNA; nuclear RNA; nRNA; RNA polymerase; RDRP; differentiation; inactivation

分化の際に多くの遺伝子は不活性化されていく。我々は、この不可逆的な不活性化を引き起こしていると考えられている核RNA(nRNA)の存在を証明してきた。今回の研究の目的は、(1)この特異的なnRNAの塩基配列を決定するとともに、(2)DNA合成期に新しく合成されたDNA鎖とハイブリダイズして遺伝子の不活性化を継承するnRNAを合成するRNA合成酵素(RDRP)を検出・抽出・精製し、さらに(3)その遺伝子をつりあげ、塩基配列を決定することである。我々は、マウス肝細胞からRNAを抽出し、電気泳動で流した後、ナザンブロティングでセルロースフィルターに写した。次に、肝細胞では発現されていないGlial fibrillary acidic protein(GFAP)に特異的な塩基配列をDNA合成機で合成した。このcDNAをP^<32>で標識し、肝からのRNAとハイブリダイゼイションを行った。この結果、バンドが認められ、肝細胞にGFAPのRNAの存在が示唆された。これは、遺伝子を不活化しているnRNAと考えられ、nRNAの塩基配列は不活化させる遺伝子と相補的と考えられる。さらに現在、DNAの混入の可能性を防ぐために、肝細胞から得たRNAをNuclease H,Nuclease P1などで処理して検討を加えている、遺伝子の不活化を継承するためのRDRPを検出するために、マウス胎児から、Downey et al(1972)の方法で、抽出・精製の段階でFraction1,2and3と粗精製液を得た。RDRP活性の測定も同様に彼らの方法で行った。RDRP活性は、H^3-UTPの生成物への取り込み量で測定し、単位はcounts per minute(cpm)である。鋳型に、Calf thymus DNAを用いた時、Fraction1,2&3のRDRP活性は、174.5,140.0&186.5であり、rRNAを用いた時、345.0,167.5&239.0であった。さらに、mRNAに用いた時、413.0,233.5&404.0と鋳型のないnegative controlの233.0,138.5&196.0に比し高値を示し、マウス胎児にわずかながらもRNA依存性RNA合成活性の存在が示された。しかしながら、この酵素は非常に不安定であり、精製には成功していない。このRDRPの遺伝子をつりあげるのはいまだ成功しておらず、今後の検討が必要である。

In the process of differentiation, many genes are not activated. The existence of nuclear RNA(nRNA) is proved by the study of irreversible inactivation. The objectives of this study are: (1) to determine the nucleotide sequence of specific nRNA;(2) to identify, extract, purify, and (3) to determine the nucleotide sequence of RNA synthase (RDRP) that supports the inactivation of DNA fragments during DNA synthesis. The liver cells were isolated from the cells, and the cells were isolated from the cells. In addition, liver cells develop Glial fibrillary acidic protein(GFAP), a specific nucleotide sequence that is synthesized by DNA synthesizers. This cDNA <32>sequence is encoded in the RNA sequence. The results showed that GFAP RNA was present in hepatocytes. NRNA is not activated, and its nucleotide sequence is not activated. In addition, the possibility of DNA mixing is also discussed. RNA is extracted from hepatocytes. Nuclease H,Nuclease P1 is processed. The inactivation of DNA is carried out. The RDRP is extracted. The method of Downey et al(1972), extraction and purification of fractions 1, 2 and 3 is obtained. The determination of RDRP activity was carried out in the same way as the other methods. RDRP activity, H^3-UTP products, and the determination of the amount of single counts per minute(cpm) RDRP activity of Fraction1, 2 &amp; 3 was 174.5, 140.0 &amp; 186.5 when Calf thymus DNA was used, and 345.0, 167.5 &amp; 239.0 when rRNA was used. The high values of 413.0, 233.5 &amp; 404.0 and 233.0, 138.5 &amp; 196.0 for mRNA expression indicate the existence of RNA-dependent RNA synthesis activity. The enzyme is very unstable and refined. The RDRP's legacy is a success story, and future discussions are necessary.