遺伝子改変コクサッキーウイルスＢ群３型を用いた新規腫瘍溶解性ウイルス療法の開発

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平成26年度には以下の研究を実施した。①昨年度に引き続き抗腫瘍免疫誘導能向上の為のコクサッキーウイルスB群3型（CVB3）の遺伝子改変を行い、昨年度作製したプロテアーゼ切断法よりもさらに高効率に切断可能な新たなプロテアーゼ切断法を開発し、効率良くGM-CSFの発現を可能としたCVB3-GM-CSFを作製した。次に、本CVB3-GM-CSFを用いたin vivo抗腫瘍効果の検討を行ったところ、CVB3-GM-CSF投与群は野生型CVB3投与群と比較して有意に腫瘍の退縮を認めた。以上のように我々はエンテロウイルスを用いた初の抗腫瘍効果増強が可能な高効率GM-CSF発現ウイルスの開発に成功した。②安全性向上遺伝子改変コクサッキーウイルスB群3型（CVB3）において、GMP準拠の試薬・機材を用い、ガス透過性バッグを使用した無血清浮遊細胞培養法を開発し、従来のウイルス製造法の約100倍の製造に成功した。その後のウイルス精製法においては、臨床試験を視野に入れた限外濾過法および密度勾配超遠心法を組み合わせた精製法を開発した。本精製後のSDS-PAGE後ゲルを用いたオリオール蛍光染色による夾雑物タンパク質確認試験おいて、精製物はウイルス培養液上清と比べ、夾雑物バンドが殆ど確認されずウイルスバンドが1本のみ確認され、夾雑物を殆ど除去出来ていることが示唆された。全行程を経ての力価及び品質は前臨床試験に供することが十分可能なレベルであった（無菌性試験陰性、エンドトキシン検出限界以下、マイコプラズマ試験陰性）。現在、本製造法で作製した試験物を用いて、サル及びマウスにおける毒性試験を実施中である。