Identification of Bacterial and Fungal Proteases that Activate Gasdermin Family Molecules to cause Pyroptosis

激活 Gasdermin 家族分子导致细胞焦亡的细菌和真菌蛋白酶的鉴定

基本信息

批准号：
22K19426
负责人：
土屋晃介
金额：
$ 3.83万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

パイロトーシスは、ネクローシス様の形態変化を伴うプログラム細胞死の一種であり、炎症誘導や感染防御に関わる。その誘導には細胞質蛋白であるガスダーミン(GSDM) ファミリー分子の成熟化が必須であり、ヒトでは5種類（GSDMA - GSDME）、マウスでは9種類のGSDMが存在している。完全長GSDMは未熟型であり活性を示さないが、特定のプロテアーゼによって切断されることで成熟化する。現在までにGSDMを成熟化させる宿主プロテアーゼが数種類同定されている。一方、細菌/真菌由来プロテアーゼがGSDMを切断してパイロトーシスを正または負に制御する可能性も考えられる。しかし、これまでにそのような報告例は少ない。本研究では、GSDM分子を成熟化・不活化する細菌/真菌由来プロテアーゼを探索する。さらに、そのようなパイロトーシスの制御が感染病態に与える影響を明らかにする。今年度、細菌/真菌由来プロテアーゼがGSDM分子を切断する可能性を検討する目的で、ヒトの全5種類のGSDM（GSDMA - GSDME）のリコンビナント蛋白を作製した。さらに、これらの蛋白標品を細菌/真菌の培養上清と反応させて切断をウエスタンブロットで検出したところ、緑膿菌の培養上清中にGSDMDを切断する活性が認められた。そこで、緑膿菌が産生する主要なプロテアーゼとしてLasA, LasB, AprA, protease IV, AP28, AP56, PASP, MucDの8種類の遺伝子をクローニングした。これらの緑膿菌プロテアーゼをヒトGSDMD発現HEK293細胞およびコントロールHEK293細胞に強制発現させたところ、AprAとMucDがGSDMD発現細胞にのみ膜傷害害を引き起こした。この結果から、AprAとMucDがGSDMDを活性化する可能性が示唆された。

凋亡是一种程序性细胞死亡，涉及坏死样形态变化，并参与诱导炎症和感染的保护。细胞质蛋白气（GSDM）家族分子的成熟对于这种诱导至关重要，在人类中，五种类型的GSDM（GSDMA -GSDME）和小鼠中的九种GSDM。全长GSDM不成熟，不会显示活性，但是当被特定蛋白酶裂解时会成熟。迄今为止，已经确定了成熟GSDM的几种宿主蛋白酶。另一方面，细菌/真菌蛋白酶也可能会裂开GSDM并呈阳性或负面作用。但是，到目前为止，很少有这样的报告。在这项研究中，我们探讨了成熟和失活的GSDM分子的细菌/真菌蛋白酶。此外，阐明了这种凋亡控制对传染病状态的影响。今年，我们创建了所有五种人GSDM（GSDMA -GSDME）的重组蛋白，目的是研究细菌/真菌衍生的蛋白酶可以切割GSDM分子的可能性。此外，当这些蛋白质标本与细菌/真菌培养物上清液反应并通过蛋白质印迹检测到裂解时，观察到铜绿假单胞菌培养上清液中裂解GSDMD的活性。因此，将铜绿假单胞菌产生的八个基因克隆出来：LASA，LASB，APRA，蛋白酶IV，AP28，AP56，PASP和MUCD。当这些铜绿假单胞菌蛋白酶被迫在表达GSDMD的HEK293细胞中表达并控制HEK293细胞时，APRA和MUCD仅在表达GSDMD的细胞中引起膜损伤。这些结果表明APRA和MUCD可能会激活GSDMD。