ブリルアン・ラマン同時イメージングによる細胞内局所環境のラベルフリー定量の実現

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本研究は細胞内の液液相分離(LLPS)の物性解明を目的とする。細胞内のLLPSとは、あるタンパク質が液滴と呼ばれる非常に高濃度の構造物を形成する現象を指し、ストレス応答や酵素反応など様々な生理現象に関与するとされる。さらに、神経変性疾患において、LLPSはタンパク質の線維凝集の前段階であると提案されている。本研究では、ラマン散乱とブリルアン散乱を組み合わせた新たなイメージングシステムを用い、液滴内の水の量、タンパク質濃度と構造、動的変化のラベルフリー定量の確立を目的とする。液滴、ゲル、線維を定量的に判別し、線維化を示す液滴の共通性質を解明する。本年度の研究では、神経変性疾患関連タンパク質として、マチャド・ジョセフ病の発症に関与するポリQタンパク質であるアタキシン3を用いて、タンパク質液滴の経時変化を観測した。タンパク質液滴は数マイクロメートル程度の大きさのため、液滴内部を詳細に解析するためには、高い空間分解能が要求される。そこで、はじめに高開口数の対物レンズを用いてゼラチンの測定を行い、ブリルアンスペクトルが過去の報告と同一の傾向を示すことを確かめ、高い空間分解能で液滴を観測できることを確認した。続いて、緩衝溶液中でタンパク質液滴を作成し、その経時変化をブリルアン・ラマンスペクトルの同時測定により追跡した。液滴のブリルアンスペクトルに波数の異なる2つのピークが観測されたことから、液滴内に液体様成分と固体様成分が共存することがわかった。時間経過に従い、固体成分に由来すると考えられるバンドの強度が増加したが、ラマンスペクトルのアミドIバンドのシフトはブリルアンスペクトルの変化に対して遅れていることを検出した。このことから、液滴の相転移が生じてから多段階でタンパク質のβシート化が進んでいることがわかった。