赤外レーザーによる世界最高速細胞解凍技術の創出とその凍結困難細胞への応用

本研究では，CO2レーザを用いた世界最高速細胞解凍の実現と，凍結保存困難な生体試料への応用を目指している．R４年度は以下の項目について研究を行った．・インクジェットヒータヘッド機構の開発．これまでは細胞内包液滴をできる限り小さくすることで凍結速度を向上させ，高い生存率を目指していたが，本年度の研究結果より20 pL液滴まで小さくすると，生存率が著しく低下することが確認された．これについて，落下中の液滴を伝熱と流体の錬成解析をしたところ，液滴が冷却面周囲から発される低温の風により冷却され，着滴前に0℃以下となることが確認された．そこで，落下中の予冷を防ぐヒーターヘッド機構を開発したところ，生存率を約15 %向上した．・凍結液滴のための長期保存容器開発．前年度に開発した液滴単独落下法で回収した凍結液滴のための専用長期保存容器を開発した．回収した凍結液滴を，一般的な樹脂製チューブ内などで保存すると，保管中の僅かな昇華による生存率低下や液体窒素の流入による細胞数減少が確認されていた．一方で，開発した専用容器を用いることで，生存率低下を約5 %防ぐことに成功し，解凍後の細胞数も大幅に改善された．・Self-quenchingを用いた液滴の凍結状態評価．前年度確立した蛍光Self-quenchingに基づくガラス化評価法を用いて，細胞内包液滴の凍結状態の評価を行った．細胞を内包したまま凍結した液滴を共焦点観察することで，200 pLでは針状の細胞外氷晶を無数に確認したのに対し，70 pLでは針状まで氷晶が成長しておらず粒状であることを確認した．さらに，細胞内環境をアルブミンで模擬して観察したところ，200 pLでは細胞内環境でも針状の氷晶が発生していたのに対し，70 pLでは氷晶が発生していなかった．これにより，これまで理論的な検討に留まっていた細胞の臨界冷却速度を実験的に推定した．

本研究では，CO2レーザを用いた世界最高速細胞解凍の実現と，凍結保存困難な生体試料への応用を目指している．R４年度は以下の項目について研究を行った．・インクジェットヒータヘッド機構の開発．これまでは細胞内包液滴をできる限り小さくすることで凍結速度を向上させ，高い生存率を目指していたが，本年度の研究結果より20 pL液滴まで小さくすると，生存率が著しく低下することが確認された．これについて，落下中の液滴を伝熱と流体の錬成解析をしたところ，液滴が冷却面周囲から発される低温の風により冷却され，着滴前に0℃以下となることが確認された．そこで，落下中の予冷を防ぐヒーターヘッド機構を開発したところ，生存率を約15 %向上した．・凍結液滴のための長期保存容器開発．前年度に開発した液滴単独落下法で回収した凍結液滴のための専用長期保存容器を開発した．回収した凍結液滴を，一般的な樹脂製チューブ内などで保存すると，保管中の僅かな昇華による生存率低下や液体窒素の流入による細胞数減少が確認されていた．一方で，開発した専用容器を用いることで，生存率低下を約5 %防ぐことに成功し，解凍後の細胞数も大幅に改善された．・Self-quenchingを用いた液滴の凍結状態評価．前年度確立した蛍光Self-quenchingに基づくガラス化評価法を用いて，細胞内包液滴の凍結状態の評価を行った．細胞を内包したまま凍結した液滴を共焦点観察することで，200 pLでは針状の細胞外氷晶を無数に確認したのに対し，70 pLでは針状まで氷晶が成長しておらず粒状であることを確認した．さらに，細胞内環境をアルブミンで模擬して観察したところ，200 pLでは細胞内環境でも針状の氷晶が発生していたのに対し，70 pLでは氷晶が発生していなかった．これにより，これまで理論的な検討に留まっていた細胞の臨界冷却速度を実験的に推定した．