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母性因子と胚性因子による初期胚の発生と分化制御機構の解明

阐明母体和胚胎因素控制早期胚胎发育和分化的机制

基本信息

批准号：
22KJ1686
负责人：
山本琢人
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

受精前のマウスGV期卵母細胞へ母性因子を標的としたsiRNAを導入しノックダウンする昨年度開発した手法を用いて、マウス初期胚発生におけるH3.3の役割の解析を行った。GV期卵母細胞へH3.3を標的としたsiRNAを導入した結果、7割以上のmRNAの分解が確認された。さらに、雄性前核ではH3.3タンパク質が取り込まれていないことが確認された。H3.3のmRNAが分解された胚では受精率に対照区との違いは見られなかったが、2細胞期への発生率が著しく低下したことから、受精後の発生には雄性前核へのH3.3タンパク質の取り込みが不可欠であることが明らかとなった。胚性因子の解析については、昨年度に引き続きMycとPwp1に注目して研究を行った。MycのmRNAを標的としたアンチセンスオリゴによりmRNAを分解した場合と、転写因子としての活性に必要なMYC-MAXの複合体形成を阻害剤により阻害した場合の両方において、マウス受精卵の発生は2細胞期で停止した。さらに、RNA-seqにより網羅的な遺伝子発現解析を行った結果、MYCの機能を阻害した胚では胚性ゲノムの活性化が阻害されていることが明らかとなった。Pwp1については、受精から2時間後にエレクトロポレーションによってsiRNAを導入し、ノックダウンを行い、発生への影響を検討した。Pwp1は大規模な胚性ゲノムの活性化が起こる2細胞期後期に転写が行われており、Pwp1がノックダウンされた場合胚盤胞期への発生率が対照区の胚と比較して有意に低下し、分化に関わるマーカー遺伝子の発現に変化が見られた。さらに免疫蛍光染色の結果、PWP1タンパク質は2細胞期から核に局在し、胚盤胞期には将来胎児となる内部細胞塊に優先して局在することが明らかとなり、哺乳類の初期発生における最初の分化である内部細胞塊と栄養外胚葉への分化に関与していることが示唆された。

Introduction of siRNA targeting maternal factors into pre-fertilization oocytes and analysis of H3.3 gene fragments during early embryo development The results of siRNA introduction into GV oocytes targeting H3.3 and mRNA decomposition above 7 were confirmed. The male pronucleus is H3.3. The male pronucleus is H3.3. The male pronucleus is H3.3. H3.3 mRNA is decomposed in the embryo, and the fertility rate in the embryo is lower than that in the 2-cell stage, and the fertility rate in the male pronucleus is lower than that in the H3.3 mRNA. The analysis of embryogenic factors in the past year has attracted the attention of Myc and Pwp1. Myc mRNA targets are not available for mRNA decomposition, and the activity of the transcription factor is necessary to inhibit the formation of Myc-MAX complexes. In addition, RNA-seq analysis results show that MYC function is blocked by the activation of the embryo. Pwp1 is introduced, fertilized, and 2 hours later, siRNAs are introduced, processed, and produced. Pwp1 was activated on a large scale during the late stage of the 2-cell cycle, and Pwp1 was activated during the late stage of the 2-cell cycle. The results of immunoluminescence staining showed that PWP1 protein was related to the differentiation of the embryo and embryo in the early stages of mammalian development.