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イヌiPS細胞由来赤血球による新規輸血療法の実現に向けた基盤技術の構築

建立利用犬iPS细胞来源的红细胞实现新型输血疗法的基础技术

基本信息

批准号：
22KJ2618
负责人：
木村和人
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2618/
关键词：
イヌ iPS細胞赤血球輸血ゲノム編集中胚葉造血幹細胞赤芽球

项目摘要

多分化能と自己複製能を有するiPS細胞は、献血ドナーに依存しない赤血球の安定供給源となりうるため、輸血用血液不足の問題を解決できると期待されている。本研究では、ゲノム編集により、赤血球マーカーレポーターイヌiPS細胞株の樹立を行うこと、およびイヌiPS細胞を用いた効率的な赤血球作製法を明らかにすることを目的としている。現在までに以下の成果が得られている。1. ゲノム編集によるレポーターイヌiPS細胞株の樹立：赤血球系譜マーカーのGYPA遺伝子座に対するガイドRNA、両側のホモロジーアーム配列、Cas9遺伝子およびGFP遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築に成功している。さらに、エレクトロポレーション法により作製したベクターをイヌiPS細胞へ導入することで、目的の遺伝子座へのノックインに成功したことが示唆される細胞クローンが得られている。2. イヌiPS細胞の培養条件の検討：イヌiPS細胞から赤血球を作製するうえで、イヌiPS細胞培養条件の効率化は非常に重要である。そこで、ヒト幹細胞用市販培地および足場剤がイヌiPS細胞培養へ応用可能か検討した。その結果、StemFlexまたはmTeSR Plus培地とVitronectinまたはGeltrexの足場剤を組み合わせることで、週末の培地交換なしに効率よくイヌiPS細胞を培養可能であることが明らかになった。3. 中胚葉への分化誘導法の検討：赤血球は中胚葉組織に由来する。そのため、赤血球への分化誘導の第１ステップとして、中胚葉への分化誘導法を検討した。その結果、GSK3β阻害剤を培地に添加して1日培養することで、中胚葉マーカーであるTBXT遺伝子発現が、GSK3β阻害剤の濃度依存性に増加することが明らかになった。

iPS cells are dependent on the ability to differentiate and replicate themselves and are expected to solve the problem of insufficient blood for transfusion. The aim of this study is to establish a method for the production of erythrocytes. The following results are now available. 1. The establishment of iPS cell lines by using the gene assembly: the GYPA gene locus of erythroid pedigree was successfully constructed by carrying the gene assembly, RNA, Cas9 gene and GFP gene. In addition, the method for controlling the expression of iPS cells was successfully used to express the expression of iPS cells. 2. The study of iPS cell culture conditions: iPS cells and erythrocytes are very important for the production of iPS cells. The market for stem cell culture and the market for iPS cell culture may be used for research. Results: StemFlex Plus, Vitronectin, Geltrex, and the like are available for cell culture. 3. A study on induction of mesodermal differentiation: origin of erythrocytes and mesodermal tissues. The first method of differentiation induction of erythrocytes and mesoderms is discussed. The results showed that the GSK3β inhibitor was added to the culture medium for 1 day, and the TBXT gene was produced in the mesoderm. The concentration dependence of the GSK3β inhibitor increased.