イヌiPS細胞由来赤血球による新規輸血療法の実現に向けた基盤技術の構築

建立利用犬iPS细胞来源的红细胞实现新型输血疗法的基础技术

基本信息

批准号：
22KJ2618
负责人：
木村和人
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2618/
关键词：
イヌ iPS細胞赤血球輸血ゲノム編集中胚葉造血幹細胞赤芽球

项目摘要

多分化能と自己複製能を有するiPS細胞は、献血ドナーに依存しない赤血球の安定供給源となりうるため、輸血用血液不足の問題を解決できると期待されている。本研究では、ゲノム編集により、赤血球マーカーレポーターイヌiPS細胞株の樹立を行うこと、およびイヌiPS細胞を用いた効率的な赤血球作製法を明らかにすることを目的としている。現在までに以下の成果が得られている。1. ゲノム編集によるレポーターイヌiPS細胞株の樹立：赤血球系譜マーカーのGYPA遺伝子座に対するガイドRNA、両側のホモロジーアーム配列、Cas9遺伝子およびGFP遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築に成功している。さらに、エレクトロポレーション法により作製したベクターをイヌiPS細胞へ導入することで、目的の遺伝子座へのノックインに成功したことが示唆される細胞クローンが得られている。2. イヌiPS細胞の培養条件の検討：イヌiPS細胞から赤血球を作製するうえで、イヌiPS細胞培養条件の効率化は非常に重要である。そこで、ヒト幹細胞用市販培地および足場剤がイヌiPS細胞培養へ応用可能か検討した。その結果、StemFlexまたはmTeSR Plus培地とVitronectinまたはGeltrexの足場剤を組み合わせることで、週末の培地交換なしに効率よくイヌiPS細胞を培養可能であることが明らかになった。3. 中胚葉への分化誘導法の検討：赤血球は中胚葉組織に由来する。そのため、赤血球への分化誘導の第１ステップとして、中胚葉への分化誘導法を検討した。その結果、GSK3β阻害剤を培地に添加して1日培養することで、中胚葉マーカーであるTBXT遺伝子発現が、GSK3β阻害剤の濃度依存性に増加することが明らかになった。

具有多动和自我更新能力的IPS细胞可以是不依赖献血者的红细胞的稳定来源，并有望解决血液短缺问题的输血问题。这项研究旨在通过基因组编辑建立红细胞标记的狗IPS细胞系，并阐明使用犬IPS细胞生成红细胞的有效方法。迄今为止，已经实现了以下结果：1。通过基因组编辑来建立记者狗IPS细胞系：我们成功地构建了一个质粒载体，该质粒载体载有指导RNA，载有红细胞谱系标记的GYPA基因座，两边的同源性臂序列，Cas9和GFP基因。此外，通过将电穿孔引入犬IPS细胞产生的载体，已经获得了一个细胞克隆，这表明该载体被成功地将其撞到靶基因基因座中。 2。研究犬IPS细胞的培养条件：在制备犬IPS细胞的红细胞时，提高犬IPS细胞培养条件的效率非常重要。因此，我们研究了是否可以将商业可用于人类干细胞的培养基和脚手架剂应用于犬IPS细胞培养物。结果表明，通过将STEMFLEX或MTESR加培养基与玻璃体蛋白或Geltrex脚手架剂相结合，可以有效地在不改变培养基的情况下有效地培养犬IPS细胞。 3。检查诱导中胚层分化的方法：红细胞是从中胚层组织得出的。因此，作为诱导红细胞分化的第一步，我们研究了诱导中胚层分化的方法。结果，据揭示，当将GSK3β抑制剂添加到培养基中并培养一天时，中胚层标记TBXT基因的表达是中胚层标记物，以GSK3β抑制剂的浓度依赖性方式增加。