機能膜アセンブリーにおけるリン脂質の挙動と役割の極性基種特異性

磷脂行为的极性基团物种特异性及其在功能膜组装中的作用

基本信息

批准号：
60214003
负责人：
渋谷勲
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1985
资助国家：
日本
起止时间：
1985 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

膜の機能発現におけるリン脂質極性基構造の特異的な役割、ならびに膜アセンブリーにおける各リン脂質の挙動の特異性を明らかにするため、大腸菌およびパン酵母の系で次の2方向の研究を行った。大腸菌の主要膜リン脂質の一つカルジオリピンの生合成触媒酵素カルジオリピンシンターゼについて、その構造遺伝子と考えられるcLs遺伝子およびその周辺の2.5Kbpの塩基配列を決定し、DNA一次構造から諸解析を行った。配列上唯一可能なリーディングフレーム1,242bpが存在しており、このcLs遺伝子はオペロンの一員で、上流の新たに見出された遺伝子のプロモーターにより転写されること、およびcls遺伝子の発現にはこの上流遺伝子の飜訳が共役する必要があることが判明した。さらにプラスミド上でcls遺伝子の中央部に1.5kbのカナマイシン耐性遺伝子を挿入し、DNAポリメラーゼI温度感受性株の染色体相同部分と組み換え、cls遺伝子の完全欠損変異株の作成に成功した。この株はカルジオリピンシンターゼを欠くが、培地条件によっては野生株並みに生育できるので、大腸菌にとってcls遺伝子およびその産物は必須ではないと結論される。一方、パン酵母の含窒素リン脂質de novo生合成の開始過程の酵素ホスファチジルセリンシンターゼの構造遺伝子PSSについても、その塩基配列を決定し、PSS遺伝子の両端を欠く断片を挿入した組み込みベクターおよびPSS遺伝子の大部分を他の遺伝子(LEU2)と置き換えたDNA断片それぞれを用い、染色体上のPSS遺伝子を完全破壊することができた。これら完全欠損株では、いずれもホスファチジルセリンおよび同シンターゼが検出されないが、エタノールアミンまたはコリンを培地に添加すると生育可能であった。これらの株の諸特性を解析し、酵母細胞におけるホスファチジルセリンの意義について多くの知見を得た。

为了阐明磷脂极性群结构在膜功能表达中的特定作用，以及每个磷脂在膜组装中的行为的特异性，在大肠杆菌和贝克的酵母系统中进行了以下双向研究。确定了大肠杆菌中主要的膜磷脂之一，确定了CLS基因周围的2.5 kbp核苷酸序列，这是结构性基因，以及周围的2.5 kbp，基于主要的DNA结构分析了CLS基因。序列上有一个独特的阅读框，其中1,242 bp是一个独特的阅读框架，发现CLS基因是操纵子的成员，并由新发现的基因上游基因的启动子转录，CLS基因的表达要求该上游基因的翻译被共轭。此外，将1.5 kb的卡纳米霉素耐药基因插入质粒的CLS基因的中心部分，并与DNA聚合酶I温度敏感性菌株的染色体同源部分重新组合，从而导致CLS基因完全缺失的突变株的产生。尽管这种菌株缺乏心磷脂合酶，但在某些中等条件下它可以像野生菌株一样生长，并且可以得出结论，CLS基因及其产物对于大肠杆菌不是必不可少的。另一方面，酶磷脂酰丝氨酸合酶的结构基因PSS的核苷酸序列，这是在启动含氮的磷脂生物合成的过程中被其他基因（LEU2）代替，用于完全破坏染色体上的PSS基因。在这些完全不足的菌株中，磷脂酰丝氨酸和合成酶均未在其中两个检测到，但是当将乙醇胺或胆碱添加到培养基中时，它们能够生长。分析了这些菌株的各种特征，并获得了有关磷脂酰丝氨酸在酵母细胞中的重要性的丰富知识。